分子生物学方法鉴定微生物(1)

1、.1微生物分子生物学鉴定微生物分子生物学鉴定微生物分类学定义：微生物分类学定义：按微生物的亲缘关系和进化规律按微生物的亲缘关系和进化规律把它们安排成条理清楚的各种分类单元把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群的科学。或分类群的科学。.2微生物的鉴定微生物的鉴定主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找权威性鉴定手册权威性鉴定手册鉴定方法分四个水平鉴定方法分四个水平：细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营养要求及生长条件等养要求及生长条件等细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、细胞组

2、分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、光合色素等的分析光合色素等的分析蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等等1. 基因或基因或DNA水平：核酸分子杂交水平：核酸分子杂交、（、（G+C）mol%、转、转化和转导、化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、寡核苷酸族分分析、DNA或或RNA核苷酸序列分析等核苷酸序列分析等.3类别类别DNADNA碱基比例的测定碱基比例的测定 全基因组序列的测定全基因组序列的测定随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平 核酸分子杂交核酸分子杂交.4 一、

3、一、DNADNA的碱基组成的碱基组成(G+C)mol%(G+C)mol% (G+C)mol%= A+T+G+CG+CX100% 1)DNA碱基比例的测定 是指是指（G + CG + C）mol%mol%值值，简称，简称“GCGC比比”，表示表示DNADNA分子中鸟嘌呤和胞嘧啶所占的摩尔百分比值。分子中鸟嘌呤和胞嘧啶所占的摩尔百分比值。AT间仅形成间仅形成2个个氢键，氢键，GC间可形成间可形成3个个氢键。氢键。GC值根据样品的值根据样品的Tm值值计算。计算。.5通过核酸分析鉴定微生物遗传型生物生物GCGC比的特点比的特点亲缘关系亲缘关系相近的相近的种，其种，其GCGC比比也相近也相近；反之，；反

4、之，GCGC比相近的两比相近的两个种，它们的亲缘关系则个种，它们的亲缘关系则不一定不一定都很接近。都很接近。GCGC比比差距很大的差距很大的两个种，其亲缘关系必然两个种，其亲缘关系必然较远较远。GCGC比是建立新比是建立新分类单元分类单元时的可靠指标时的可靠指标 GCGC比相差比相差2%5%5%时，为不同种；时，为不同种； GCGC比相差比相差10%10%时，为不同属时，为不同属。.6 测定测定DNA碱基组成的方法：碱基组成的方法： 由于热变性温度法操作简单、重复性好而最为常用。由于热变性温度法操作简单、重复性好而最为常用。 基本原理：将基本原理：将DNA加热，两条单链逐渐被打开，从而加热，两

5、条单链逐渐被打开，从而使使DNA溶液溶液260nm紫外吸收明显增加，称紫外吸收明显增加，称DNA的增色的增色效应。效应。G+C增加，所需温度也较高，当温度高达一定增加，所需温度也较高，当温度高达一定值时，值时，DNA完全分离成单链，此后紫外吸收不再增加。完全分离成单链，此后紫外吸收不再增加。 DNA的热变性过程的热变性过程(即增色效应的出现即增色效应的出现)是在一个狭窄的是在一个狭窄的温度范围内发生的，紫外吸收增加的中点值所对应的温温度范围内发生的，紫外吸收增加的中点值所对应的温度称为该度称为该DNA的热变性温度的热变性温度(Tm)。在一定条件下，。在一定条件下，DNA的的Tm值与值与DNA的

6、的G+Cmol%成正比。成正比。 Tm69.30.41（G+Cmol）.7.8二、核酸分子杂交二、核酸分子杂交DNA-DNA DNA-DNA 杂交法杂交法DNA-rRNA DNA-rRNA 杂交法杂交法rRNA-rRNA rRNA-rRNA 杂交法杂交法杂交同源性杂交同源性: : 60%, 60%, 同种同种 70%, 70%, 同一亚种同一亚种 20%-60%, 20%-60%, 同一属同一属按碱基的互补配对原理，用按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条人工方法对两条不同来源的不同来源的单链核酸进行单链核酸进行复性（退火）复性（退火），以构建新的杂合双链核酸的以构建新的杂合双链核酸的技术技术

7、.9 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 DNA-DNA杂交 基本原理：双链基本原理：双链DNA分子加热可变性，冷却处理时，又可复性。分子加热可变性，冷却处理时，又可复性。不仅同一菌株的不仅同一菌株的DNA单链可以复性结合成双链，来自不同菌株单链可以复性结合成双链，来自不同菌株的的DNA单链，只要二者具有同源互补的碱基序列，它们也会在单链，只要二者具有同源互补的碱基序列，它们也会在同源序列之间互补结合形成双链，这就称之为同源序列之间互补结合形成双链，这就称之为DNA-DNA分子杂分子杂交。不同微生物之间，交。不同微生物之间，DNA同源程度越高，其杂交率就越高，同源程度越高，其杂交率就越高，若两个菌株

8、若两个菌株DNA分子序列完全相同，则应分子序列完全相同，则应100%地杂交结合。地杂交结合。 具体测定方法很多，按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂具体测定方法很多，按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类。在这些方法中，有的需要交两大类。在这些方法中，有的需要用同位素标记用同位素标记DNA，有的，有的则用非同位素标记，而则用非同位素标记，而复性速率法复性速率法则是通过测定单链则是通过测定单链DNA分子分子复性结合的速率来计算复性结合的速率来计算DNA的同源性而不需要对的同源性而不需要对DNA分子进行分子进行标记。标记。 .10细菌常用固相杂交法： （参照菌株）（参照菌株）A菌菌 B菌

9、（待测）菌（待测） DNA DNA （ 同位素标记、酶切并解链）同位素标记、酶切并解链）单链单链 单链（固定于滤膜上，未标记）单链（固定于滤膜上，未标记） 最适温度复性杂交最适温度复性杂交 洗涤洗涤 测定放射强度测定放射强度 杂交率杂交率（以参照菌株自身复性的放射性值为百分之百（以参照菌株自身复性的放射性值为百分之百 ） 60%同一个种；同一个种；70%同一亚种；同一亚种；2060%同属不同种同属不同种 对于许多有争议的对于许多有争议的种种的界定和建立的界定和建立新种新种起了重要作用起了重要作用 .11.12 DNA-rRNA杂交杂交 rRNA是是DNA转录的产物，在生物进化过程中，其碱基转录

10、的产物，在生物进化过程中，其碱基序列的变化比基因组要慢得多，保守得多，它甚至保留序列的变化比基因组要慢得多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些碱基序列。因此，当两个菌株的了古老祖先的一些碱基序列。因此，当两个菌株的DNA-DNA杂交率很低或不能杂交时，用杂交率很低或不能杂交时，用DNA-rRNA杂杂交仍可能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较交仍可能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间的关系，进行属和属以上等级分类关系更远的菌株之间的关系，进行属和属以上等级分类单元的分类。单元的分类。 DNA-DNA杂交和杂交和DNA-rRNA杂交的原理和方法基本相杂交的原理和方法

11、基本相同，只是在技术细节上有些差异，如同，只是在技术细节上有些差异，如DNA-rRNA杂交中，杂交中，用同位素标记的是用同位素标记的是rRNA而不是而不是DNA等等。等等。.13 核酸探针核酸探针 广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生物检测以及分子生物学许多领域。物检测以及分子生物学许多领域。 所谓核酸探针所谓核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链一段单链DNA或或RNA分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探针用于微生物鉴

12、定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。 根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至更大类群范围的微生物的检测或鉴定。更大类群范围的微生物的检测或鉴定。 例如，从一株淋病奈瑟氏菌例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)隐蔽性质隐蔽

13、性质粒制备的粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这种引起人类性行为传播疾病的细菌。种引起人类性行为传播疾病的细菌。.14 使用核酸探针来鉴定或检测微生物的方法，是将探针与所检测的使用核酸探针来鉴定或检测微生物的方法，是将探针与所检测的细菌进行杂交。在细菌鉴定或检测临床标本中的细菌时，常用菌细菌进行杂交。在细菌鉴定或检测临床标本中的细菌时，常用菌落原位杂交法，大致步骤是：将细菌落原位杂交法，大致步骤是：将细菌点种点种于硝酸纤维素膜上进行于硝酸纤维素膜上进行培养培养；加溶菌剂使细胞；加溶菌剂使细胞释放出释放出DNA分子分子；加变性剂使；加

14、变性剂使DNA离解离解成成单链单链并并固定固定于膜上；加入带于膜上；加入带标记标记的核酸探针进行的核酸探针进行杂交杂交；洗膜洗膜后后进行显色或显影进行显色或显影鉴定鉴定。 用核酸探针来鉴定或检测微生物，具有准确、快速等优点，特别用核酸探针来鉴定或检测微生物，具有准确、快速等优点，特别是当用常规方法难于鉴定和检测时，往往更显示其优越性。是当用常规方法难于鉴定和检测时，往往更显示其优越性。.15三、三、rRNArRNA寡核苷酸编目分析寡核苷酸编目分析利用利用16SrRNA16SrRNA建立分子进化树的美国科学家建立分子进化树的美国科学家 Carl WoeseCarl Woese 60年代末年代末W

15、oese 开始采用寡开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细类，他通过比较各类生物细胞的核糖体胞的核糖体RNA(rRNA)特征特征序列，认为序列，认为16SrRNA及其类及其类似的似的rRNA基因序列作为生物基因序列作为生物系统发育指标最为合适。系统发育指标最为合适。.16三、三、rRNArRNA寡核苷酸编目分析寡核苷酸编目分析 一种通过分析原核或真核细胞中最稳一种通过分析原核或真核细胞中最稳定的定的rRNArRNA寡核苷酸序列同源性程度，以寡核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。的方法。是

16、是“三域学说三域学说”提出的科学根提出的科学根据。据。 .17选用选用rRNArRNA做生物进化和系统分类的原因做生物进化和系统分类的原因rRNArRNA普遍存在普遍存在, ,易于提取易于提取; ; rRNArRNA重要恒定的生理功能重要恒定的生理功能; ;在细胞中含量高，易于提取；在细胞中含量高，易于提取；编码编码rRNArRNA的基因在细胞中不像质粒的基因在细胞中不像质粒DNADNA那样会转移，而是十那样会转移，而是十分稳定的分稳定的 ；rRNArRNA某些核苷酸序列非常保守，历经进化仍能保持原初某些核苷酸序列非常保守，历经进化仍能保持原初相对分子量适中相对分子量适中原核生物原核生物rRN

17、ArRNA：23S23S（29002900）、）、16S16S（15401540）和和5S5S（120120） 真核生物真核生物rRNArRNA：28S28S（40004000）、）、18S18S（23002300）和和5.8S5.8S（160160）.18核糖体构造和组分模式图原核生物原核生物小亚基小亚基(30S)大亚基大亚基(50S)16S rRNA21种种核糖体蛋白核糖体蛋白23S rRNA34种种核糖体蛋白核糖体蛋白5S rRNA真核生物真核生物小亚基小亚基(40S)大亚基大亚基(60S)18S rRNA33种种核糖体蛋白核糖体蛋白28S rRNA51种种核糖体蛋白核糖体蛋白5.8S

18、rRNA.19 原理原理： 用一种用一种RNARNA水解酶水解水解酶水解rRNArRNA后，产生一系列长后，产生一系列长短不一的寡核苷酸片段，电泳分离，放射自显影技短不一的寡核苷酸片段，电泳分离，放射自显影技术获得指纹图谱，确定不同长度寡核苷酸斑点在电术获得指纹图谱，确定不同长度寡核苷酸斑点在电泳谱上的位置，泳谱上的位置，找出图谱中链长在找出图谱中链长在6 6个核苷酸以上个核苷酸以上的寡核苷酸片段作序列分析的寡核苷酸片段作序列分析，获得的结果进行按不，获得的结果进行按不同长度进行编目、列表。通过比较、分析、计算，同长度进行编目、列表。通过比较、分析、计算，就可知道各菌株间的亲缘关系大小。就可知

19、道各菌株间的亲缘关系大小。 若两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其产若两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其产生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。rRNArRNA寡核苷酸寡核苷酸编目分析编目分析.20实验过程：实验过程： 将事先用将事先用3232P P标记的标记的被测菌株被测菌株rRNArRNA提纯提纯，用可专一水解，用可专一水解G G上上33端端磷酸酯键的磷酸酯键的T1RNAT1RNA酶酶进行水解，于是产生一系列以进行水解，于是产生一系列以G G为末端为末端的长的长度不一的度不一的寡核苷酸片段寡核苷酸片段，接着把它们进行双向电泳分离，再用，接着把

20、它们进行双向电泳分离，再用放射自显影放射自显影技术获得技术获得rRNArRNA寡核苷酸群的寡核苷酸群的指纹图谱指纹图谱，然后将图谱，然后将图谱中链长在中链长在6 6个核苷酸以上的个核苷酸以上的寡核苷酸作序列分析，把获得的结果寡核苷酸作序列分析，把获得的结果按不同长度进行编目、列表。通过比较计算和分析，就可定量按不同长度进行编目、列表。通过比较计算和分析，就可定量地知道各被测菌株间的地知道各被测菌株间的亲缘关系亲缘关系。rRNArRNA寡核苷酸寡核苷酸编目分析编目分析.21培养微生物培养微生物提取基因组提取基因组DNADNArDNArDNA序列测定序列测定分析比较分析比较微生物之间的系统发育关系

21、微生物之间的系统发育关系16S rDNA16S rDNA微生物鉴定流程微生物鉴定流程PCRPCR扩增扩增16S rDNA16S rDNA片段片段.22从样品中分离提取总微生物从样品中分离提取总微生物DNA 从样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA，这是进行PCR扩增16S rRNA的前提。 一种方法是直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取，另一种选择是提取微生物细胞中的rRNA。RNA的提取技术相对于 DNA的提取较为复杂，一般多采用提取细胞总 DNA，但也可根据情况选择提取 rRNA。.23PCRPCR扩增扩增16S rRNA16S rRNA基因片段基因片段 聚合酶链

22、式反应聚合酶链式反应 (PCR)，又称体外基因放大技术，是将，又称体外基因放大技术，是将DNA样本与寡样本与寡核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷和耐热的核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷和耐热的TaqDNA聚合酶在一种适当的缓冲聚合酶在一种适当的缓冲液中混合，然后进行循环的扩增反应。由于液中混合，然后进行循环的扩增反应。由于PCR技术的产生和发展，现在技术的产生和发展，现在一般采用一般采用16S rRNA引物引物PCR扩增总扩增总DNA中的中的rRNA序列，或通过反转录序列，或通过反转录PCR获得获得cDNA序列后再进行分析。采用序列后再进行分析。采用PCR技术的优点在于不仅一次性技术的优点在于不仅一次性从混

23、合从混合DNA或或RNA样品中扩增出样品中扩增出16S rRNA序列，而且方便了后面的克隆序列，而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会出现和测序。但也同样会出现PCR所固有的缺点，尤其是采用所固有的缺点，尤其是采用16S rRNA保守序保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增，可能出现嵌合产物列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增，可能出现嵌合产物(Chimeric product)和扩增偏嗜性现象，影响结果的分析。和扩增偏嗜性现象，影响结果的分析。 PCR扩增步骤如下：（扩增步骤如下：（1）双链）双链DNA（模板）加热变性为单链；（模板）加热变性为单链； （2）引物与模板）引物与模板

24、DNA单链结合；单链结合； ( 3) 引物延伸（扩增）。引物延伸（扩增）。 .24通过通过 16S rRNA16S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定基因片段分析对微生物进行分类鉴定16S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下4种：一是将 PCR扩增后微生物16SrDNA序列，提交到GeneBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。GenBank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类。与16S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置二是通过16S rRNA种属特异性的探针与 PCR产物杂交以获得微生物组成信息。此

25、外,探针也可以直接与样品进行原位杂交检测，通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度，而且能够分析它们的空间分布。三是对 PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系，用以揭示微生物RFLP的多样性。四是对PCR扩增产物进行梯度凝胶电泳分析，直接观察其多样性.25 通过通过T1RNAT1RNA酶的水解，一般可使酶的水解，一般可使rRNArRNA形成含有形成含有1 12020个核苷酸个核苷酸单位的寡核苷酸片段。如果形象地把只含一个核苷酸的片段称为单位的

26、寡核苷酸片段。如果形象地把只含一个核苷酸的片段称为“字母字母”的话，则含两个以上核苷酸的片段就成了的话，则含两个以上核苷酸的片段就成了“单词单词”。将。将含有含有6 6个个“字母字母”以上的所有以上的所有“单词单词”一一测定其核苷酸序列，一一测定其核苷酸序列，最后可把它们编成一部最后可把它们编成一部“词典词典”。于是，两个茵株。于是，两个茵株rRNArRNA的相似性的相似性就可通过查阅就可通过查阅“词典词典”来作比较。比较的具体方法是计算它们间来作比较。比较的具体方法是计算它们间的缔合系数（的缔合系数（associatedcoefficientassociatedcoefficient）或相关

27、系数）或相关系数SABSAB值：值： .26 上式中，上式中，N NABAB是是A A、B B两被测菌株所共同具有的两被测菌株所共同具有的“单词单词”的的“字母字母”数，而数，而N NA A和和N NB B则是两株菌分别具有的则是两株菌分别具有的“单词单词”的的“字母字母”数。根数。根据据S SABAB值进行数值分析，就可推知它们之间的亲缘关系。值进行数值分析，就可推知它们之间的亲缘关系。 它的作用很大，至今它的作用很大，至今WoeseWoese及其同事已对及其同事已对400400多株细菌和放线菌多株细菌和放线菌进行过分析，并从其中发现了生命的第三种形式进行过分析，并从其中发现了生命的第三种形式古细菌，古细菌，提出了生物界级分类中的提出了生物界级分类中的“三域学说三域学说” .27三域学说及其发展三域学说及其发展 1980（Woese） 16sRNA16sRNA共同的祖先共同的祖先古细菌域：产甲烷细菌、极端嗜盐菌、极端嗜酸热菌古细菌域：产甲烷细菌、极端嗜盐菌、极端嗜酸热菌真细菌域：除古细菌原界以外的细菌真细菌域：除古细菌原界以外的细菌真核生物域：原生生物、真菌、动物、植物真核生物域：原生生物、真菌、动物、植物.28嗜热菌嗜热菌真细菌原界真细菌原界紫色细菌紫色细菌G+细菌细菌绿色非绿色非硫细菌硫细菌蓝细菌蓝细菌