第三章细胞生物学研究方法1

1、第三章 细胞生物学研究方法进行初步观察进行初步观察形成可验证的假说形成可验证的假说设计对照试验设计对照试验收集资料收集资料解释结果解释结果作出合理结论作出合理结论查阅已查阅已有知识有知识生物学研究模式生物生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制不同物种享有共同分子机制Caenorhabditis elegansDrosophila melanogasterArabidopsis thaliana破碎破碎细胞器细胞器组份组份形态观察形态观察细胞培养细胞培养离心分离离心分离染色染色免疫技术免疫技术分子生物学分子生物学标记标记教学目的、要求教学目的、要求1cm 1mm 100um 10um 1um

2、 100nm 10nm 1nm 0.1nm光学显微镜光学显微镜电子显微镜电子显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜肉眼分辨率：肉眼分辨率：0.2mm0.2mm光学显微镜分辨率：光学显微镜分辨率：0.20.2m m 电子显微镜分辨率：电子显微镜分辨率：0.2nm0.2nm几种显微镜的分辨范围几种显微镜的分辨范围一、光学显微镜一、光学显微镜1.普通复式光学显微镜普通复式光学显微镜 2.荧光显微镜荧光显微镜 4.激光共焦点扫描显微境激光共焦点扫描显微境 3.暗视野显微镜暗视野显微镜 5.相差显微镜相差显微镜 偏光显微镜偏光显微镜 6.微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜 7.倒置显微镜倒置显微镜 各种光学显

3、微镜的特性比较各种光学显微镜的特性比较当代显微镜的发展趋势当代显微镜的发展趋势v普通生物显微镜由普通生物显微镜由三三部分部分构成：构成：照明系统照明系统光学放大系统光学放大系统机械装置机械装置v原理：经物镜形成倒立实原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。像，经目镜进一步放大成像。1. 普通复式光学显微镜普通复式光学显微镜指显微镜能分辨物体最小间隔指显微镜能分辨物体最小间隔的能力。的能力。0.61 分辨率分辨率 DN . sin （ / 2）=w制片：固定（甲酫）、包埋（石蜡）切成制片：固定（甲酫）、包埋（石蜡）切成厚约厚约5 m的薄片以便观察。的薄片以便观察。w染色：伊红和美蓝特异地

4、与不同蛋白质结染色：伊红和美蓝特异地与不同蛋白质结合，品红特异地显示合，品红特异地显示DNA的所在部位。的所在部位。4. 4. 激光共焦点扫描显微境激光共焦点扫描显微境（laser scanning confocal microscopy,laser scanning confocal microscopy,LCSM ） 共焦点共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点。即它们互相共焦点。LCSMLCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 u比普通荧光显微镜的分辨率提高比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4-1.71

5、.4-1.7倍。倍。u由于可自动改变观察的焦平面而且纵向分辨率（由于可自动改变观察的焦平面而且纵向分辨率（axial resolution）得到改善，所以可以通过得到改善，所以可以通过“光学切片光学切片”观察较厚样品的内部结构。观察较厚样品的内部结构。u将改变焦点获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构将改变焦点获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。出样品的三维结构。相差显微镜相差显微镜 ( (phase contrast microscope) )Frits Zernike1953Frits Zernike1953年年Nobel Nobel 物理学奖物理学

6、奖1. 1. 分离直射光和衍射光分离直射光和衍射光 2. 2. 使直射光和衍射光之间产生干涉，使相位差变成振幅差使直射光和衍射光之间产生干涉，使相位差变成振幅差, , 表现为明与暗的对比表现为明与暗的对比秀丽杆线虫秀丽杆线虫 C. elegans C. elegans 用于观察未染色样品用于观察未染色样品, , 能够观察到无色透明的能够观察到无色透明的活的物体活的物体。组成和普通显微镜一组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之下，后者在载物台之上，载物台之上，用于观用于观察培养的活细胞，具察培养的活细胞，具有相差物镜。

7、有相差物镜。各种光学显微镜的比较各种光学显微镜的比较透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜n用于电镜的标本须制成厚度约用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。左右的超薄切片。2、制样技术、制样技术超薄切片超薄切片负染技术负染技术冰冻蚀刻冰冻蚀刻v电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机的超薄切片，用超薄切片机ultramicrotome）制作。）制作。v通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片

8、，重金氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。属（铀、铅）盐染色。Page59超薄切片超薄切片技术主要技术主要包括取材、包括取材、固定、包固定、包埋、切片、埋、切片、染色等步染色等步骤。骤。Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are

9、 easily seen. Negative Stained Archaebacteria Negative Stained Actin用次氯酸钠用次氯酸钠Page 61酵酵母母细细胞胞扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。工作原理工作原理v 用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集

10、，并在那里被闪烁器转变为光信号，由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。描图像。v 图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。的轰击下发出次级电子信号。antigen-presenti

11、ng cells， APCs扫描扫描电镜电镜电镜电镜光镜光镜总体形态总体形态 颜色颜色 内部结构内部结构 表面形态表面形态 三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜（扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由由Binnig等等1981年发明，年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 分辨率：横向为分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达，纵向可达0.001nm。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。观察。 STM image of a DNA

12、molecule细胞组分分析细胞组分分析物理方法物理方法化学方法化学方法免疫学方法免疫学方法分子生物学方法分子生物学方法离离 心心组织染色组织染色流式细胞流式细胞细胞电泳细胞电泳免疫标记免疫标记放射性自显影放射性自显影吸收光谱吸收光谱第二节、细胞组分的分析方法利用肝脏制备利用肝脏制备各种亚细胞组各种亚细胞组分的制备离心分的制备离心过程示意图过程示意图 匀浆物匀浆物肝脏肝脏上清夜上清夜完整完整 细胞细胞完整完整 细胞细胞1000g 20min核核线粒体线粒体 溶酶体溶酶体 过氧化物酶体过氧化物酶体微粒体微粒体内质网内质网100000g 120min105000g 20minDNase静置静置20

13、min10000g 20min核糖体核糖体CsCl密度密度梯度梯度离心离心蔗糖蔗糖密度密度梯度梯度离心离心 低速离心低速离心 中速离心中速离心 高速离心高速离心 超高速离心超高速离心 细胞匀浆细胞匀浆细胞细胞 核仁核仁 细胞骨架细胞骨架大细胞器大细胞器小细胞器小细胞器核糖体核糖体 大分子大分子 离心离心 样品样品蔗糖的稳定梯度蔗糖的稳定梯度 慢速沉降成分慢速沉降成分 快速沉降成分快速沉降成分分画分画样品样品蔗糖的不蔗糖的不连续梯度连续梯度 低浮力密低浮力密度成分度成分 高浮力密高浮力密度成分度成分 二者结合二者结合1. 1. 固定固定物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。物理固定：血膜空气快速

14、干燥、冷冻干燥。化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。多用甲醛丙酮缓冲液固定。 步骤：步骤：2. 2. 显示方法显示方法金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成生成CuS或或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。有色沉淀，而显示出酶活性。Schiff反应：细胞中的醛基可使反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（变为红色。

15、用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。反应）。联苯胺反应：过氧化酶分解联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。茚三酮反应：显示蛋白质。茚三酮反应：显示蛋白质。金属沉淀法金属沉淀法Schiff反应反应联苯胺反应联苯胺反应脂溶染色法脂溶染色法F. 米伦（米伦（Millon）染色：显示蛋白质（红色）染色：显示蛋白质（红色）酪氨酸残基与氮汞试剂反应酪氨酸残基与氮汞试剂反应 免疫细

16、胞化学是根据免疫学原理，利用免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体抗体同同特定特定抗原抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。结合，对抗原进行专一定位测定的技术。 如果将抗体结合上如果将抗体结合上标记物标记物，再与组织中的抗原，再与组织中的抗原发生反应，即可在发生反应，即可在光镜光镜或或电镜电镜下显示出该抗原存下显示出该抗原存在于组织中的部位。在于组织中的部位。免疫细胞化学免疫细胞化学(immunocytochemistry)(immunocytochemistry)三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：

17、直接法直接法间接法间接法间间接接免免疫疫细细胞胞化化学学法法的的原原理理示示意意图图次级次级 抗体抗体初级初级 抗体抗体标记物标记物第一抗体（一抗）第一抗体（一抗）第二抗体（二抗）第二抗体（二抗）1. 免疫荧光技术免疫荧光技术Immunofluorescence technique ：抗原抗原-抗体特异结合与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原抗体特异结合与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。在细胞内分布的方法。用Alexa488标记的抗人-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色(常规荧光显微镜照片，Shi Qinghua等)用抗用抗-

18、tubulin抗体染色显示微管抗体染色显示微管(绿色绿色); 细胞核细胞核: 红色红色, DAPI染色染色(激光共聚焦显微镜照片激光共聚焦显微镜照片) 2. 免疫电镜技术免疫电镜技术 Immune electron microscopy：通过通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等位与骨架蛋白的定位等 用免疫电镜方用免疫电镜方法法,观察到寇氏隐甲观察到寇氏隐甲藻的多条凝集染色藻的多条凝集染色体和细胞中的金颗体和细胞中的金颗粒粒,并且细胞核内、并且细胞核内、核膜上的金颗粒簇

19、核膜上的金颗粒簇集相对于胞质中相集相对于胞质中相对集中对集中,指示了指示了ACA抗抗CJFD2003通常用通常用*原位杂交原位杂交： 指用标记的核酸探针通过分子杂交确定指用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或者在细胞中的位置的方法。特异核苷酸序列在染色体上或者在细胞中的位置的方法。五、放射自显影术五、放射自显影术v用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。等。v原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，原理：将放射性同位素标记

20、的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。射性曝光，使乳胶感光。v一般用一般用14C和和3H标记。常用标记。常用3H-TDR来显示来显示DNA，用，用3H-UDR显示显示RNA；用；用3H氨基酸研究蛋白质，用氨基酸研究蛋白质，用3H甘甘露糖、露糖、3H岩藻糖研究多糖。岩藻糖研究多糖。 14C半衰期为半衰期为5730年，年，3H为为12.5年。年。2. 2. 显微光谱分析技术显微光谱分析技术v细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自

21、己酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。特征性的吸收曲线。v可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。定性和定量测定。细胞培养细胞培养动物细胞培养动物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养原代细胞培养原代细胞培养传代细胞培养传代细胞培养群体细胞培养群体细胞培养克隆细胞培养克隆细胞培养组织培养组织培养原生质体培养原生质体培养单倍体细胞培养单倍体细胞培养 病病 毒毒一、细胞培养一、细胞培养(一一)、动物细胞培养、动物细胞培养选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。的技术。 动物细胞的生存环

22、境与植物细胞差别很大，动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。因而二者的培养方法很不相同。(一一)、动物细胞培养、动物细胞培养 原代细胞原代细胞(primary culture cell) 从动物机体取出的进行培养的细胞群从动物机体取出的进行培养的细胞群 。有人也把。有人也把培养的第培养的第2代细胞与传代细胞与传10代以内的细胞统称为原代代以内的细胞统称为原代培养细胞。培养细胞。 有限细胞系有限细胞系(finite cell line) 从原代细胞群中筛选出的仍保持原来染色体的二从原代细胞群中筛选出的仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制性，能够繁殖倍体数量及接触抑制

23、性，能够繁殖40-50代左右的代左右的传代细胞。传代细胞。永生细胞系永生细胞系(infinite cell line) 细胞发生遗传突变，并带有癌细胞的特点，可能细胞发生遗传突变，并带有癌细胞的特点，可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为称为永生细胞系永生细胞系。 如：如：HeLa细胞系、细胞系、BHK21细胞系、细胞系、Vero细胞系、细胞系、CHO细胞系细胞系细胞株：细胞株：具有特殊遗传标记或性质的细胞群体。具有特殊遗传标记或性质的细胞群体。原原代代培培养养1. 定义：通过培养和介导，两个或多个细胞合并成定义：通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为