高效液相色谱固定相的新进展1020

1、 内容小滑流色谱法580年粒子进步和限制579核壳粒子580整体柱581 商品柱 581 专家和供应商继续在高效液相色谱法(HPLC)的理论、性能和实用性方面取得进步理论。它是最常用的分析技术，而且几乎跨越了每一个化学的应用。 许多使用者,甚至于是运行高效液相色谱仪器许多年的成功者并且产生有用的数据,可以从最近的知识如什么是可能的、什么改变了、什么即将发生中获益。当没有可靠的方法即替换的成本和潜在收益是不确定时，几乎没有动力去更新或替换旧的。 对于先进的的医师来说，明白现在什么是必要的和即将发生的是至关重要的。 我们将主要侧重于发展的最后2年,但将包括几个以前的重要性的报告。引用可以并不透彻,

2、但能表示表示最近的工作和进展。 虽然高效液相色谱法和超临界流体色谱(SFC)仍然是单独练习,它们的区别开始模糊,许多固定相都可以被用于这两个技术。 所以,我们将纳入一些发展来适用于超临界流体色谱。同时,非手性固定相将是我们的重点。 手性固定相的发展最近在这个杂志上被报导。 似乎有尽可能多的描述类型的创新有作者写关于创新的过程。最简单和最常见的创新是连续的,也就是说,推断或直接和可预测性的扩展是从当前实践中获取的。最大的和最重要的创新,真正的游戏改变者,是不连续的。 他们在提高或替换当前的实践的过程中，被描述为激进的、革命性的或破坏性的。高效液相色谱法是建立在大量的创新之上的。仪器要求泵、进样器

3、、探测器、记录器、数据处理等的发展。流动相的创新包括混合溶剂(调整强度),梯度洗脱,缓冲区和添加剂的使用,温度控制(当然这也影响到固定相的化学性),和出口压力控制(使浓缩或压缩气体加入流动相)。固定相的创新包括更好的吸附剂,结合相,薄膜粒子,孔隙大小控制,球形粒子,B型二氧化硅、手性固定相,边缘盖,极封端,嵌入式极性基团,混合的二氧化硅,聚合物粘结等。这些改进当连续或不连续时，作为他们实际需要的能力并不是很重要。 小粒子的进步性和局限性 完全多孔固定相粒子的直径在高效液相色谱法的历史以相当规律的速度减小。在1970年中期，10m直径的 粒子被广泛应用。 直径减少的好处是完全可预测的,颗粒大小(

4、和塔板高度)减少与泵的改善,附加柱体积的减少,数据采集的快速性相关,直到在1990年商业粒子达到约2.5m。在40-MPa(6000 - psi)泵要求实际的粒度的限度,特别是如果一个缓冲在一种方法中是需要的，允许一个柱的使用如果柱的电阻会随年份的增长或者是一个粘性溶剂系统(比如水-甲醇)所需要的。 整体柱大约1996年出现。第一个商业产品出现在2000年,是具有破坏性的:填料塔的时间相比,这些整体柱有可能显著地提高塔板高度和速度分析,他们需要相当少的压力。对于常规的包装柱在效率和速度方面竞争,颗粒大小必须减少到2m以下,输送压力必须大幅增加,附加柱体积缩小 。因此诞生了超高效液相色谱法(UH

5、PLC)和能够利用近-2-m固定相的新一代的工具。 今天我们已接近甚至达到通过超高效液相简单的极限粒径减少与完全多孔粒子固定相来提高性能。 这个限制是由于流动相的摩擦加热,由此产生的径向温度梯度产生的加热,而且径向梯度导致了峰展宽。另一个限制是用当前技术使用更小的颗粒填料相同的河床的困难。额外的改进可能需要一个或多个不连续。 滑流色层分析也许最有趣的新可能性是高效液相色谱中滑流条件的使用,最近被Wei, Rogers, and Wirth所证实。图1，哈根的泊肃叶流(防滑涂层,如传统的高效液相色谱法)和滑流。 通道是速度矢量箭头。 注意,在通道壁上有哈根-泊肃叶条件的速度是零而不是在通道壁上有

6、移动滑流条件。 还要注意滑移流条件速度范围的减少。 滑流,图1,在微机电系统(MEMS)是一个著名的现象:在普通流道壁(无滑动或哈根泊肃叶流)条件下流动相流速为零,与传统的高效液相色谱法,但通道直径的减少最终导致滑流条件，即流动相实际上与通道壁的表面移动的相反。结果是相比于没有流动条件下的压力，所需的压力的大幅降低。 另一个好处峰展宽的大量减少，在流动通道中速度窄的范围,这些速度差异是传统的高效液相色谱法的扩大的主要来源。 作者使用470 nm煅烧的二氧化硅胶体粒子，泥浆挤进75 -m直径2.5厘米长床熔融石英管然后甲烷硅基化的。 作者显示色谱使牛血清白蛋白和标记的单克隆antiprostat

7、e特异抗原,他们取得了超过一百万理论板块在大约2分钟。还有大量工作要做这个演示变成实际的能力。 例如,没有报告但性能与小的溶质。 方便注射提供极其微小的初始乐队是必需的。 作者发现使用荧光显微镜和溶质乐队直接在列,所以postcolumn检测仍有待探索。 此外,实际列必须开发生产技术。然而,如果潜在的最终意识到在工作中,这将是一个真正的颠覆性创新。 现在我们将注意力转向广泛实践技术的最新进展。核壳粒子实芯颗粒涂上一层薄薄的固定相,最初叫薄膜的但今天被称为核壳粒子,在1960年代开始他们的工作Horvath)等al.5和Kirkland.6商业版本2007.7开始出现在他们当前的格式从那时起已经

8、有大约150的报告,应用程序和评论在这一快速增长的领域。这些粒子比完全多孔填料提供了许多好处。 首先,他们有更好的降低板高度;完全多孔粒子必须比核壳粒子直径较小的三分之一提供类似的板的一代。 有一些分歧的原因改进性能。人们普遍声称改善是由于有限的溶质穿透深度的壳,从而提高传质,狭窄的粒度分布对大多数核壳材料提供更均匀的床。 Guiochon和Gritti报告,传质改善贡献有限壳壁厚度是可以忽略不计的小溶质(虽然大溶质筛选了与快速流动相速度受益于限制扩散深度),提高效率的出现主要是由于减少涡流分散,粒径分布窄不负责。 Tallarek等人也曾大量研究包装和运输质量。 核壳列的第二个好处是,他们需

9、要1/2到1/3的操作压力比列完全相同的外形尺寸挤满了多孔粒子提供相同的塔板数。 因此,与核壳列,可以生成高板数字在短的时期,就像在UHPLC,但在系统与常规抽水能力是否足够注意扩大的贡献注入,连接,和检测。第三,导热系数较高的核壳列由于固体粒子的核。 2、16、17的径向温度梯度较低比列完全多孔的颗粒 相同的粒度与流动相的速度。更好的散热允许进一步减少核壳粒子的大小(甚至更好的性能)之前遇到流动相加热问题。 商业核壳阶段颗粒1.3m nowoffered一样小。 减少颗粒大小是由需求驱动的小板高度,更快的分析时间和更高的塔板数来实现用户所需的分离。 板高度提高随着粒径减小,但增加的成本压力必

10、须提供所需的流量。改进的性能通过减少颗粒大小可以进行,只要额外的压力是可用的(和所有的组件系统可以生存和加热不成为限制)。 然而,如果需要更高的平皿计数后解决问题的压力达到极限,则必须增加粒度和列延长进一步提高塔板数。这增加的成本分析。 因此,我们看到两个最近的趋势:(1)较小的核壳粒子的发展来改善塔板高度(每秒和盘子)和分析时更高的压力,和(2)更大的核壳粒子的发展提供更高的压力限制车牌。 这是特别重要的用户系统与“传统”压力的能力需要更多的板块来解决一个问题。 核壳列和几个不同的键合相化学反应可从越来越多的供应商。 表1列出的例子列在撰写本文时可用。此外,工作继续开发新的核壳材料。 Pae

11、k等人介绍了一层薄的铝到2.7 -m核壳粒子然后沉积一层碳铝。效率是准备在多孔氧化锆比比类似的阶段。 刘et al .,利用自组装技术,大大增加反相材料的碳含量比常规程序。 21日李等人生长纳米大小的氧化锆晶体表面的二氧化硅微球。 22兰登等人准备reversedphase核壳粒子使用碳芯涂有聚(烯丙胺)和金刚石,然后用C18功能化表面和C8 。他们的材料是稳定在高pH值和温度升高。 轻轻溶质保留效率很好,但降低塔板高度约为20 well-retained化合物。 最后,孔隙大小最初sub-3-m 90100 -一系列的核壳粒子,但申请多肽,蛋白质,和其他大的溶质需要阶段大毛孔。舒斯特尔等人开

12、发了一个160 -一个毛孔,具有核壳结构的固定相适用于溶质15 000哒。 相似的阶段已经出现商业从其他供应商。表征和性能已经被几组调查。Gritti等测量和相关物理粒子特性和性能Olah等人相比,核壳列中的传质和巨石。Fekete et pared性能大大小小的溶质在1.7 -m核壳粒子,发现高流率可以用来改善分析时间没有大型塔板数。Gritti和Guiochon检查传质动力学在几个核壳材料。太阳之等人,Dioszegi等人还研究了动态性能。各种高效液相色谱性能主题讨论了其他一些论文。Lesellier检查核壳的动力学性能在证监会静止阶段。核壳固定阶段的范围的应用程序本质上是完全一样多孔粒子

13、。例如,最近的报告解决脂质,sulfanoamides、酚类和多酚。Chirita等人相比,离子对和反相方法分析儿茶酚胺使用核壳固定阶段。他们发现与离子对的方法更好的结果。DeGrasse等人分开贝类毒素和报道,使用核壳固定相相比完全多孔粒子节省分析时间的三分之二。应用核壳列亲水相互作用色谱法(HILIC)也出现。由于核壳的强一致性范围和totall yporous粒子,我们不会讨论核壳粒子在否则常规一维液相色谱中的应用进一步细节。曾有一些报道说使用的核壳固定阶段二维液相色谱中速度,特别是在第二个维度,是一个重要的考虑。Chocholous等人相比,核壳与整体柱列sequential-inje

14、ction色谱法(原文如此),发现都可以使用。整体柱 而核壳阶段相对困难的准备,和进步是来自相对较少的专家和专业制造商,巨石的情况完全不同。他们相对容易的准备已经使许多独立研究人员参加,并已经取得了很大进展。已经有超过600 2010年以来的期刊文章和评论。读者新技术,2007年的一项审查Guiochon提供历史的角度来看,和承诺的未来技术。其他几个最近的评论也推荐。商业棒 第一个商业整体柱,叫做Chromolith(默克公司),出现在2000年。这是一个4.6毫米100毫米monolithic-silica杆,携带,使用C18和包装在一个聚(醚醚酮(PEEK)夹克与高效液相色谱配件。本专栏吸

15、引了太多的关注由于其良好的效率(板高度大约10m有利的溶质,不坏)和非常低的压力要求产生流动相流。低压力是由于这个庞然大物的高渗透,所以高流率可以用来缩短分析时间比典型的3.5 -m多孔粒子受欢迎。然而,这些整体柱受到径向不均匀棒有限的性能。同时,许多用户认为价格是无耻比传统列。所以,尽管有一个良好的开端,第一代silica-rodmonoliths没有garnermuch UHPLC引入后的额外注意。2最近改变在生产过程中提高了色谱性能,但这新一代的silica-rod列需要约4倍比早期版本更大的压力。63年、64年这将是有趣的,看看这一代是被用户接受。无机巨石。巨石可以由硅,从其他无机物(

16、usuallymetal氧化物),fromorganic材料开始,或者是混合动力车。硅胶材料的生产最近被Trojer et al .,总结Ghanem Ikegami,El狄。整块石料生产从其他氧化物经过Gawel et al.68沃尔什等人关注nonsilica inorganicmonoliths。许多这些aremuch不同硅表面化学反应,可以提供不同的选择性。有机和高分子巨石。制备、表征和性能的有机或高分子巨石几个评论的主题:Nischang等人指出,多孔聚合物巨石是有用的在各种各样的应用程序,包括液相色谱和微流体设备。他们讨论了制备、稳定性和鉴定。另外,Nischang等人研究了制备聚

17、合物单体对大众运输和对小溶质分离的影响。他们得出的结论是,整体结构的不均匀性限制了性能和与更好的准备巨石小溶质的性能具有一定的挑战性。ml李的集团最近审查准备和床毛细管独石结构,将这些与传统的高效液相色谱固定相,对小型溶质和检查性能。李的团队最近还描述准备C18-incorporated巨石,两性离子的巨石,基于聚甲基丙烯酸酯和阳离子交换巨石。周等人所描述的制备聚(dimethylsiloxane)修改庞然大物用于反相分离。Badaloni等人使甲基丙烯酸己酯和乙二醇利用整块材料在毛细管中使用辐射引发聚合。作者应用这个nano-HPLC /质谱分析,他们发现列是稳定的。Krajnc等人回顾了最

18、近应用甲基丙烯酸酯单体与强调理解表征和交互机制。混合整块材料。朱镕基和行总结混合硅基和混合聚合物的制备和应用巨石,指出,这些列在高效液相色谱中的应用。Vujcic等人回顾organosilica-hybrid巨石和金属氧化物巨石,特别是锆和铪。他们报告潜在的用于蛋白质组学。吴等人讨论了合成和使用多面体低聚物的silsesquioxane作为交联制备混合巨石。83王等人最近准备混合庞然大物的代码与亲水和强大anionexchange交互。Jandera等人混合列传统C18或aminopropyl二氧化硅粒子首先的毛细管柱填料粒子,然后用丙烯酸甲酯聚合。85也许并不意外,结果列效率和渗透率中间的常

19、规包装列和巨石。选择性。巨石可以非常有选择性的将特定的功能整合到表面聚合。张等人合成混合含环糊精的庞然大物。86 Arrua等人总结最近的工作关于合成高分子巨石与纳米材料。Krenkova等人还回顾了使用纳米结构修改传授选择性巨石。88室等al.incorporated C60富勒烯聚甲基丙烯酸酯体系。他们制作了butylmethacrylate庞然大物提供更多110年比110年对苯板/ m。当他们使用碳纳米管这些作者取得了约三分之一的效率他们意识到富勒烯。90年Aqel等人也准备了nanotube-containing庞然大物。通等人结合碳nanosheets聚甲基丙烯酸酯体系。也可以实现高

20、选择性的分子印迹庞然大物的表面。棕褐色等人讨论准备,描述,这种材料在高效液相色谱中的应用和样品制备。郑等人也回顾了molecular-imprinted聚合物与重点发展和应用高效液相色谱和毛细管电色谱。94年他等人准备了一个硅胶整体柱,然后结合乙烯基组,然后注入甲基丙烯酸溶液,利用,磺胺甲嘧啶作为模板分子,离子液体porogen。作者评估结果列,发现它有选择性的磺胺甲嘧啶磺酰胺混合物。陈等人印识别dibenzoyl-Dtartaricacid的庞然大物。等人使用分子拥挤提高印独石的有效性。赵等人印ketoprofen庞然大物使用金属离子作为中介。另一种方法涉及到固定蛋白质表面的固定相,以传授理

21、想的选择性。纳达尔等人讨论protein-doped溶胶的制备和应用凝胶巨石。这样对于小分子药物筛选列是有用的。如果细胞膜蛋白质固定化,那么由此产生的技术可以被称为细胞膜色谱法或细胞膜亲和色谱法。纳达尔等人回顾了其他几个可能性有机整块材料的表面特性的变化。Tetalaet,Arrua et al .,Spross Sinz还回顾了使用巨石亲和色谱法。Pfaunmiller等人准备一些聚合物巨石将人类血清白蛋白。106年作者决定白蛋白的浓度在不同的巨石他们准备然后评估最好的使用R / S-warfarin和D /左旋色氨酸作为溶质。王等人准备二氧化硅/ TiO2-composite巨石,然后用来

22、丰富此处则通过金属氧化物亲和力。虽然没有完成,色谱法作为一种新的媒介的潜力phosphoproteomics是值得注意的。张等人开发的巨石包含固定四价或Zr4 +此处则的亲和力。侯等人还发明了一种硅monolithnwith固定化四价在phosphoproteomics旨在应用。摘要等人准备和使用亲水性聚(ethyleneglycol)的巨石净化卵白蛋白。分析应用程序还没有到来。也有巨石含有铜和铁的例子。巨石2 d-hplc系统。Morisaka等人使用第一个维度的离子交换柱和反相分离的庞然大物在第二维度的蛋白质。陈等人使用综合2 d-hplc /飞行时间质谱,用整块石料在第二个维度,从中药筛

23、选抗肿瘤成分。应用程序和其他用途。读者更喜欢专注于蛋白质组学包括使用巨石(而不是整块材料应用于蛋白质组学)可能会发现审查由Rozenbrand和van Bennekom覆盖发展到2011年的8年是有用的。此外,最近的工作报告出现了从Iwasaki et al .,Morisaka et al .,Vitorino et al .,王et al .,Zhang et al.Kortz等人提供的摘要使用巨石与质谱检测代谢物和蛋白质。郑等人最近还回顾了使用protein-modified巨石与强调手性选择。Wistuba Chankvetadze,张等人也使用巨石总结手性分离。cis-Diol化合物

24、是重要的在许多生物过程和经常出现在低浓度。Boronateaffinity色谱法提供了有用的选择性分离和确定这些溶质。李、刘最近总结了在这一领域的研究工作包括使用巨石。一些报告描述过程产生boronate-affinity巨石与特异性糖蛋白。李等人一块al.described聚合物体系包含Wulff-type boronate。刘等人准备巨石合并sulfonyl-substituted phenylboronic酸。李等人准备了silica-boronate混合使用3-acrylamidophenylboronic庞然大物酸为boronate亲和性的代理。作者指出高亲水性、高结合容量和抗碱水解

25、。刘等人准备了一份要求限制访问权限boronate亲和力多孔庞然大物作为模拟蛋白质的具体捕获抗体 HILIC阶段证监会及相关技术。极性固定相在证监会最常用,和许多HILIC阶段工作。174176西等人研究了11个商业HILIC静止阶段使用证监会与146个测试溶质的条件。176年作者比较和分类使用定量结构保留保留关系和主成分分析和评估峰值形状。静止的阶段分为三组根据他们的氢键行为。在这部作品中,流动相排斥水,所以没有HILIC保留机制。从乙腈/ aqueous-buffer或酒精/ aqueousbuffer混合物和添加二氧化碳,HILIC-like分离已报告使用enhanced-fluidit

26、y条件由几个组。多斯桑托斯佩雷拉等人添加二氧化碳在不同比率乙腈/水缓冲和乙醇/水缓冲混合物。177只有一个温度和压力,和有机溶剂/水比例是固定的。其他工作由Olesik et al.178,179菲尔波特报道,Olesik检查保持为一个固定比例的甲醇和水在不同移动phase.179二氧化碳的量从证监会的起点,泰勒最近回顾了使用水作为一种添加剂。180年更具体地说,Ashraf-Khorassani和泰勒使用水添加到各种alcohol-modified二氧化碳分离的移动阶段广泛利用极性固定几个碱基三个阶段。181帕特尔等人使用水作为一种添加剂在证监会以及离子对agents.182实际上这些分色H

27、ILIC吗?良好,表面过剩流动相的组件通常存在于证监会流程。的公司水为流动相结合的使用HILIC极性固定相当然是必要的,但这是足够的吗?阿尔珀特的描述HILIC不仅需要一些水流动相也表面多余的水。183年决定如果或当一个表面多余的水存在,研究它如何改变与条件,并检查保留行为作为所有可调参数的函数(包括水流动相浓度,水/有机比率,二氧化碳浓度,温度,压力,等等)是必要的辨别保留机制,指导进一步的研究和开发新的功能和有用的应用程序。HILIC的行为,即使在二氧化碳中流动相,是一个连续的色谱行为的一部分包括传统的反相色谱法和常规证监会;解决一个特定的分离问题的最佳条件是坐落在这continuum.1

28、84HILIC的应用程序。新HILIC阶段提供不同的选择性和新分离的可能性,所以我们将看一个简短的应用一些新阶段。Schiesel等人HILIC用于调查方法概要营养输液包含各种组件的解决方案。185年HILIC最近被用于确定碳水化合物包括低聚糖。186191李等人研究了low-MW肝素使用HILIC / ESI-Fourier-transform-MS。192年沃克等。反相和HILIC的分析方法相比derivatized N-linked聚糖。193年寻找一个平台,同时支持分离蛋白质组学和作者,他们得出的结论是,反相相当大的程度上胜过HILIC的衍生品。有几个报告关于分析核苷、核苷酸等。林等人

29、异形尿代谢物,发现生物标志物对膀胱癌和肾癌。199年Stertz等人用HILICMS /女士表明1-hydroxybutene-2-yl硫醇尿酸对人类是一种很好的生物标志物作为接触屏幕1,3 -丁二烯,致癌物。200年Spagou等人进行了大鼠尿液的代谢分析肝毒性研究的半乳糖胺和甘氨酸的保护作用。201其他几个感兴趣的报告涉及metabolites.202215在蛋白质组学中,迪帕尔马等人开发和应用策略需要100倍的小样本。216217年早些时候与蛋白质组覆盖方法。赵等人描述他们的开发的二维HILIC-reversed-phase /女士的方法快速的蛋白质组学分析。218年Garbis等人扩展

30、人类血清蛋白质组分析的多维的方法。219他们结合大小排斥、HILIC和反相分离与检测nanoelectrosprayionization -串联质谱分析。,他们发现了将近2000个蛋白质浓度和375年跨越12个数量级磷蛋白质。Zarei等。讨论了在phosphoproteomics HILIC的应用和相关技术。220 Engholm-Keller等人报道策略,涉及HILIC phosphoproteomics,他们发现了4700此处则。221年Kaji et al.222,吴al.223也研究了蛋白质组学。混合模式和可选择性HILIC和代码列之间的界限很模糊。保税阶段HILIC列上极性和亲水性

31、。指控组键合相的加入可以提高亲水性增加静电相互作用的可能性和带电溶质通过排斥效应(如静电排斥亲水相互作用色谱法,ERLIC)和离子交换。例如,添加正电荷的固定相可以提高电离基地的峰形状的酸的峰形状。224年两性离子固定阶段影响接近两性离子溶质的取向,如肽。225所以,多个交互成为可能。如果固定相是疏水性,但包含离子交换组,然后反相离子交换机制能够共存。杨和耿最近的上下文中回顾了复杂色谱生物高聚物analysis.226混合模式的存在无疑增加了复杂性方法开发,但这也增加了不可思议的力量,特别是可选择性,可以使方法开发相当容易。例如,考虑对乙酰氨基酚的分离(也称为扑热息痛)及其杂质,4-amino

32、phenol。(这是一个重要的分析问题的生产止痛药含有对乙酰氨基酚)4-Aminophenol极地,它不能被充分保留在中性ph这个反相分离溶质与酸性阳离子少甚至保留条件。即使轻微的保留是通过反相为标准,极赋形剂(如flavorants、防腐剂等)的产品也经常洗提早期和干扰4-aminophenol峰值在实际样品。从反相转向HILIC提供不同的选择性和高极性溶质的保留,但更控制保留和选择性使用mixedmode方法是可能的。Calinescu et al .,图2中,使用一个反相/阳离子交换分离的代码保留的阳离子形式4-aminophenol虽然不是大大影响reversedphase保留对乙酰氨基酚和其他非离子溶质present.227这种混合模式将允许阳离子分离溶质与伟大的定位控制进入山谷之间的非离子溶质,从而提供灵活性和可选择性容纳额外的非离子溶质,也可能出现在商业产品。这种控制是通过调节pH值(如果pKa附近得溶质或列)或流动相的浓度对非离子取代阳离子几乎没有影响溶质。相反地,改变了非离子有机改性剂浓度影响溶质在通常的反相的方式在离子溶质的影响不大。这些众多的控制可能也使扩大使用pH值的梯度,228离子强度,温度等等,除了普通的修饰符和流梯度。因此,改变的可能性选择性不仅