新药临床前毒理学科学评价

1、新药临床前毒理学科学评价Preclinical Toxicological Evaluation of New DrugContents目的意义急性毒性试验(acute)长期毒性试验(chronic)特殊毒性试验(遗传、生殖、致癌)其它毒性试验(过敏、刺激 etc.)药物非临床研究质量管理规范（GLP）SFDA新药审评会 案例学习Acute Toxicity Test概念、目的意义传统方法基本内容和要求有关问题其它实验方法Concept动物单次或24h内多次给予受试物后，一定时间内(14天)所产生的毒性反应毒理研究早期阶段进行目的意义(DO STAR)毒性剂量 Toxic Dose安全剂量范围

2、 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction: 性质、程度、量 毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生 毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性 寻找毒性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility解毒或解救措施 Antidote确保临床用药安全(重点监测指标)目的意义阐明药物毒性作用及强度、计算相对毒性参数 了解毒性靶器官为长毒、特殊毒性试验剂量设计为期临床试验起始剂量选择为临床毒副反应监护提供参考其它 (DO STAR)OECD口服急性毒性分级等 级LD50高毒（Very Toxic)25 mg/kg有毒（Toxic)25200 m

3、g/kg有害（Harmful)2002000 mg/kg不分级（Unclassified)2000 mg/kg相对毒性参数 治疗指数TI =LD50/ED50安全系数SF=LD5/ED95可靠或确实安全系数CSF =LD1/ED99安全范围SM=(LD1/ED99-1) X 100%SED50/ED50, 越大越安全LD5基本无害量 ED95基本有效量LD1肯定无害量 ED99肯定有效量为临床毒副反应监护提供参考 中毒症状,起始、持续、恢复时间中毒靶器官对抗试验为临床急救提供依据 为长毒等试验选择剂量提供依据 长期毒性剂量设计LD50法 (1/10, 1/50, 1/100)MTD法 ( 1,

4、 1/3, 1/10)生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD主要药效学剂量限度、一般药理学和药动学剂量设计也要参考急性毒性的LD50为特殊毒性试验选择剂量提供依据 致突变试验啮齿类动物微核试验高剂量为1/2 LD50果蝇伴性隐性致死试验的高、低剂量分别为1/2 LD50和1/4 LD50精原细胞染色体畸变试验高剂量=1/2 LD50 短期致癌试验高剂量=MTDI 期临床选择起始剂量提供参考 细胞毒类抗癌药，I期临床起始剂量= 1/10 LD50其 它系列化合物的合格率分析(除理化性质为主外)也参考LD50复方药物的相互作用, 也可通过拆方及合用的LD50来判别相互作用性质比较不同途径的LD50，获得一

5、些生物利用度信息，为剂型开发提供参考基本原则 执行GLP整体性具体问题具体分析 阶段性随机、对照、重复方法公认动 物获得尽量多信息前提下，使用尽量少动物 啮齿类-小鼠或大鼠 非啮齿类-犬或猴二种动物(啮齿类及非啮齿类)小鼠18-22g; 大鼠120-150g; 犬用成年犬 初始体重不应超过或低于平均体重的20%各半 (勤俭办事，服从命令)受 试 物工艺稳定、符合临床用质量标准标明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，附质检报告辅料、溶剂、试剂等应标明批号、规格和生产厂家，符合试验要求 受 试 物原料药 临床拟用剂型复方制剂：复方 + 拆方 (增毒？新毒？)易降解：含降解产物量

6、最高的受试物进行急毒试验，并与临床样品的急毒试验结果比较给药途径临床拟用途径 + 原型药物较完全进入循环途径（如静脉注射）啮齿类ig给药前应禁食12h，不禁水剂量和分组 给药剂量：未见毒性量严重毒性量设空白和/或溶媒（辅料）对照小动物4-6个剂量组, 组距0.65-0.85,求LD50大动物可用50%等量递升法(近似致死剂量法), 求出ALD和MTD，不必达到致死量 给药容积 不等浓度等容量给药常规及最大给药容量为: 动物给药途径 给药量 小鼠 ig0.2-1.0 ml/20giv、ip、sc0.1-0.5 ml/20g大鼠 ig1.0-2.0 ml/100giv、ip、sc0.5-1.0 m

7、l/100g观察指标及时间药后4h内详观, 后每天上下午各一,观察14d记录毒性反应、死亡情况, 中毒症状、发生时间、持续时间、严重程度、恢复期及动物最短、最长死亡时间其它指标：一般指标、体重变化等观 察指 征 可能涉及的器官、组织、系统 . 鼻孔呼吸阻塞，呼吸频率和 深度改变，体表颜色改变AECNS，感官，神经肌肉等 .运动功能：运动频率和特点的改变AJCNS，感官，神经肌肉等.惊厥(抽搐)：随意肌明显的无意识收缩或惊厥性收缩AECNS,呼吸衰竭,神经肌肉,自主神经 .反射AF感官，神经肌肉 .眼检指征AH自主神经；出血，感染 .心血管指征AE自主神经,CNS,心输出量降低等.唾液分泌 A自

8、主神经 .竖毛 A自主神经 .痛觉丧失 A感官，CNS .肌张力AB自主神经等 .胃肠指征AB自主神经，胃肠动力等.皮肤AB刺激性，炎症，过敏等急性毒性研究的一般观察和指征 病理学检查 大体解剖(濒死动物+死亡动物+存活动物)组织病理学检查: 体积、颜色、质地等改变时结果处理 实验资料用Bliss法计算LD50。必要时求不同性别LD50 表. XXX急性毒性结果及LD50计算剂 量 对数剂量 动物数 死亡动物数 死亡率 机率单位 LD50及可信限(mg/kg) (X) (只) (只) % (Y) (mg/kg)结果处理剂量反应、时间反应关系反应可能涉及组织、器官或系统肉眼病变和组织病检，初步判

9、断毒性靶器官病检报告应附：病检者签名+单位盖章+病理照片 确定NOAEL、 MTD、ALD etc，初步判断受试物的安全范围 综合评价判断反应与药物作用相关性：时间、发生率、剂量-反应关系动物种属及背景数据病理学检查结果同类药物特点安全范围、毒性严重程度及可恢复性毒性作用靶器官毒性可能涉及部位大体解剖和组织病理学检查结果注意问题光化学治疗药和辐射增敏剂急毒试验 照光 + 不照光分别测定LD50复方(a+b)中各组分毒性相互作用评价 注意问题充分重视预试毒理学界对LD50看法试验结果（信息）的一部分LD50测定不足：动物消耗量大获得信息有限测得数值不准EPA Policies Beyond th

10、e Limit, recommends approximate lethal dose the up-and-down methods EPA Policies Discourages the use of the Classical LD50 test Uses Structurally Related Activities (SRA) to obviate the need for testing on animals Recommends the Limit test近似致死剂量法(非啮齿类动物)6只健康Beagle犬或猴。犬6-12 m，猴2-3 y 估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。

11、按50%递增法，设计出剂量序列表 First最低致死剂量 最高非致死剂量 最低致死剂量 最高非致死剂量OR近似致死剂量范围 近似致死剂量范围 SecondMTD法最大允许浓度和最大允许容积仍未测出LD50, 可只求MTD值一次或24h多次(总量5g/kg)给20只动物观察14d, 未见死亡, 则MTD XX g/kg; 个别死亡, 则写成LD50 XX g/kgiv要求 pH 5-8，速度：大、小鼠 10-20sig时空腹, 即禁食12-16h左右常用容量和最大容量(ml)给药途径小 鼠20 g大 鼠200 g豚 鼠400 g家 兔1.5 kg犬10 kgig0.2-1.01.0-4.01.0

12、-5.05.0-10.050-100ip0.2-1.01.0-3.02.0-5.05.0-10.05-15im0.1-0.20.2-0.50.2-0.50.5-1.02-5iv0.2-0.51.0-2.01.0-5.03.0-10.035-50sc0.1-0.50.5-1.00.5-2.01.0-3.03-10 最大无毒性反应剂量（no observed adverse effect level, NOAEL) ： 指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量 最小毒性反应剂量： 动物出现毒性反应的最小剂量 最大耐受量（maximal to

13、lerance dose，MTD）： 不引起受试动物死亡的最高剂量 最小致死剂量（minimal lethal dose，MLD）： 引起个别受试动物出现死亡的剂量 半数致死量（median lethal dose, LD50）： 在一定试验条件下引起50%受试动物死亡的剂量。长 期 毒 性 试 验 Long-term Toxicity Study目的意义基本内容和要求有关问题Mechanic? Innovative ?目的意义(DO STAR)毒性剂量 Toxic Dose安全剂量范围 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction: 性质、程度、量 毒关系、产生、达峰、

14、持续时间及反复产生 毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性 寻找毒性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility解毒或解救措施 Antidote确保临床用药安全(重点监测指标)基本原则 执行GLP整体性具体问题具体分析 阶段性随机、对照、重复方法公认ProcedureAnimals Housing DrugRoute Dosage GroupDuration Index RecoveryTime Report（动饲药径剂组 周指恢时报告）Animalin vitro体系筛选实验动物种属或品系理想动物对受试物生物转化与人体相近对受试物敏感已有大量历史对照数据

15、Animals rodent non-rodent rat beagle dog mouse monkeyAnimal二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用Beagle犬, 必要时用猴、猪等符合等级要求 来源、品系、遗传背景清楚，有动物质量合格证 大鼠6-9 w， Beagle犬6-12 m,体重CV20各半 必要时，可用疾病模型动物进行试验 Duration 6m, natural death ( rat: 1y-15%, 1.5y-50%, 2y-70-80%) (勤俭办事，服从命令）XXX 体外代谢种属比较研究代谢产物Area(%)人 猴 犬 大鼠 小鼠M0 原形 84.7 63.2 47

16、.6 86.2 78.5M1 去乙基 5.63 27.7 9.87 7.35 16.4 M2-1 羟基化 - 0.26 8.19 0.17 0.69M2-2 羟基化 0.29 0.46 8.48 0.35 -结合体内动物药代结果用大鼠和猴进行安评动物选择XXXX西地那非已上市药枸橼酸钠西地那非改酸根（化4）PDE5抑制剂，治疗男性ED选用雄性动物进行下列试验急性毒性（大鼠、小鼠）安全药理学（小鼠、犬）须与已上市药物进行对比 （已上市药需国外进口或买不到时？）动物选择治疗HER2阳性乳腺癌药物治疗妇女HER2阳性乳腺癌用雌性动物进行一般毒理学研究厂家要求选用雌雄各半动物，何故？动物选择Housi

17、ngT, humidity, light, ventilation, animal feeds Rat: 5 /cage or separated， acclimation 1wDog: TB test, anthelmintic acclimation: 1-2w / 1m饲养管理主要因素动物类别小鼠、大鼠豚鼠、家兔犬温度( )20-2618-2818-28湿 度40-70%40-70%40-70%换气次数10-15次/h10-15次/h10-15次/h气流速度13-18cm/s13-18cm/s13-18cm/s压 力正 压正 压负 压洁 净 度100000级100000级落下细菌3个/皿

18、3个/皿照 明150-300 Lux150-300 Lux噪 声60 db60 db臭 气氨浓度20 ppm氨浓度20 ppmDrug test article / solvent / excipient name, batch No. , source, specification, purity, preserve condition, etc same quality criterion Route与临床用药途径一致临床iv , 大鼠给药1月，ip代替im或sc应变换注射部位必要时改变给药途径但应说明原因模拟临床给药途径纤维蛋白胶：犬腹腔给药小儿止泻贴剂：相当于脐部给药途径方式Dose

19、and Group大鼠各15只/组大动物各5只/组Dose and Group三个给药组, 单位：mg (IU)/kg 或 mg (IU)/m2不等浓度等容量给药低剂量组高于有效剂量，不出现毒性中剂量组轻微或中等度毒性高剂量组明显/严重毒性，或个别动物死亡空白对照溶媒或赋形剂溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组阳性对照特例：等浓度不等容量给药白蛋白：疗效与蛋白浓度有关紫杉醇脂肪乳：乳剂的比例影响紫杉醇安全性途径方式Correspond duration of clinical ad. with animal ad.clinical ad. durationanimal ad. duration

20、 2 w1 m2 w1 m3 m 3 m 6 m3 m6 m (rat) 9 m (dog)duration 3m ad. 6 day weekly (Mon. to Sat. ) 药物临床疗程 啮齿类 非啮齿类 可支持临床研究阶段 2周1个月 1个月1个月II期3个月3个月III期（生产）3个月3个月3个月II期6个月6个月III期（生产）6个月6个月6个月II期6个月9个月III期（生产）6个月6个月9个月II期6个月9个月III期（生产）注：表中给药期限均为最短给药期限，不包括恢复期，均为完整试验Index-Clinical Examinations rodent non-rodent

21、signs of ill health +pupil , T behavioral changes breath, sialosis reaction to treatment vomitingDead or moribund animal: necropsy within 1hIndex-Hematology 受试物对造血系统有影响，应重视骨髓检查细胞计数Red Blood Cell (RBC)血红蛋白Hemoglobin(Hb)红细胞容积Hematocrit (Hct)平均红细胞容积 (MCV)平均红细胞血红蛋白(MCH)平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)网织红细胞计数Reticulocy

22、te白细胞计数及其分类WBC & DC血小板计数Platlet凝血酶原时间Prothrombin Time (PT)Index-Clinical Chemistry天门冬氨酸氨基转换酶Aspartate Aminotransferase (AST)丙氨酸氨基转换酶Alanine Aminotransferase (ALT)碱性磷酸酶Alkaline Phosphatase (ALP)肌酸磷酸激酶Creatine Phosphokinase(CPK)尿素氮Blood Urea Nitrogen（BUN）肌酐Creatinine（Cr）总蛋白Total Protein（TP）白蛋白Albumin（

23、Alb）血糖Glucose (Glu)总胆红素Total Bilirubin（Tbill）总胆固醇 Total Cholesterol（Tch）甘油三酯Triglyceride (TG)-谷氨酰转移酶（非啮齿类动物）-GT (non-rodent)钾离子浓度K氯离子浓度Cl钠离子浓度NaIndex-Urinalysis尿液外观Color and appearance比重Specific gravitypH 值pH value尿糖Glucose尿蛋白Protein尿胆红素Bilirubin尿胆原Urobilinogen酮体Ketones潜血Blood白细胞WBC亚硝酸盐Nitrite镜检*Mic

24、roscopy of centrifuged depositIndex-Pathology称重并计算系数 calculate organ weights relative to body weight , paired organs weigh together 心脏 heart肝脏 liver脾脏 spleen 肺脏 lung肾脏 kidneys 脑 brain肾上腺adrenals胸腺 thymus睾丸 testes 附睾 epididymides子宫 uterus卵巢 ovariesIndex-Pathology病检脏器组织脑（大脑、小脑、脑干）脊髓（颈、胸、腰段）垂体胸腺甲状腺甲状旁腺

25、食管唾液腺胃小肠和大肠肝脏胆囊*肾脏肾上腺脾脏胰腺气管肺Index-Pathology病检脏器组织主动脉心脏附睾睾丸卵巢子宫前列腺乳腺坐骨神经膀胱眼（发现异常时）*视神经*给药局部骨髓淋巴结（包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结）Index-Pathology heart liver spleen lung kidney brain adrenals pancreas stomach duodenum jejunum ileum colon cecum（盲） pituitary thymus spinal cord prostate testes epididymides uterus ovari

26、es optic nerve injection site bone and marrow urinary bladder lymph nodes(mesenteric, local) thyroid & parathyroid lobes脏器取材样式（SOP)肺脏脑01 肝脏02030405 肾脏 膀胱 心脏 肺06 脾脏 胸腺07 甲状腺08 气管09 脑垂体10胃切片中组织排列和方向IndexECG, Eye大动物长期毒性必须做 ECG观察指标：心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压和Q-T间期RecoveryObservation : 1/31/2 anim

27、al, 26w Late toxic reaction and reversibility Items : same as treatment period测试次数 能反映动态变化 一般行为、食量每天观察记录大鼠体重每周一次大动物生理指标每半月一次大动物ECG 导联，给药前、给药期间、停药及恢复期均要检测发现有阳性指标应加大观察密度 Observations Western Chinese Recombinant 34 times 2 times antibody 6m(rat) 9m(dog)Toxic reaction: properties, degree, dose-toxicity

28、relationship, initiating time，peak time, lasted time, late reaction toxicity, accumulating toxi-city, tolerance Frequency of lab. investigations rat单个动物，背景数据和文献数据可参考Non-rodent：数量少、个体差异大，单个动物的试验数据具有重要毒理学意义。须与给药前、对照组和背景数据进行多重比较，文献数据参考价值有限 统计学意义和生物学意义有统计学意义并不一定有生物学意义判断因素数据变化剂量反应关系其他相关参数改变与历史背景数据比较异常数据合

29、理解释 正确判断毒性反应 给药组和对照组之间差异来源与受试物有关的毒性反应动物对药物适应性改变正常生理波动判断关注剂量反应关系参数变化幅度和性别差异分析毒理学变化参数关联和机制单个参数变化判断应慎重结合TK毒性反应对于临床试验意义 种属差异无关毒性：高剂量，非线性动力学代谢特异反应难以检测：头痛、头昏、头晕、腹胀、皮肤搔痒、视物模糊 疑毒从有机制研究（探索药理/毒理信号通路）鉴别新分子实体是否有新的药理/毒理作用机制，加深对药物的认识与已有类似药物作用比较，判断是否属于新作用机制采用多种先进的生理、生化和分子生物学方法和技术对机制进行多层次研究例：1971年美国颁布国家癌症法以来，前列腺癌、肝

30、癌、胰腺癌等发病率和/或死亡率没有明显改变Pfizer研发CETP抑制剂损失8亿$Torcetrapib的副作用源自脱靶效应辉瑞公司ILLUMINATE试验详细数据表明torcetrapib提高死亡率可能源于其脱靶效应动物研究发现切除肾上腺，可以阻断torcetrapib的升压效应，验证了醛固酮所起的作用美国转化医学协会的主席Bruce Littman指出，torcetrapib事件另一个教训是，当涉及到黑箱机制时，尤其是与安全性有关的问题时，一定不要把所观察到的问题仅仅作为风险那么简单Nat Rev Drug DiscovVOL 10 | MAR 2011 | 1632011年立普妥专利到期排名通用名商品名公司适应症2009(亿)2010(亿)1阿伐他汀立普妥辉瑞高胆固醇血症124.5114.0辉瑞急切希望torcetrapib弥补2011年立普妥专利到期带来的巨额损失，过度扩大了torcetrapib可能带来的经济效益，偏离了研发的科学性20102015，辉瑞至少失去18个药物的独家专利权。这些药物2009年销售收入达256亿美元，占总收入60%2012年全球处方药市场销售20强排名通用名商品名2012年2