生物分离工程绪论课件PPT

1、生物分离工程（Bioseparation Engineering)课程主要参考书目 生物分离工程 （第二版） 孙彦编著 Bioseparation Process Science Antonio A. Garca et al编著成绩构成平时成绩：30分 课堂测验、作业、出勤情况期末考试：闭卷考试，70分32 学时绪论 2学时细胞分离与破碎 2学时初级分离 2学时膜分离技术 6学时生物产品萃取技术 8学时色层分离技术 10学时蛋白质复性 2学时沉淀与结晶 2学时第一章 绪 论 重要性生物分离过程 特点 一般步骤工业生物分离过程 典型的生物分离过程过程的选择依据生物分离过程的重要性生物分离工程的概

2、念生物分离工程: 从粗原料中获得合乎使用要求的目标产 物的过程，包括目标产物的提取、浓 缩 、分离纯化及成品化等。多学科的交叉 多种分离技术的集成 生物工程科学研究的 （Engineering) 合乎使用最新成果 要求的产品(Science) (Product) Upstream Technology Downstream ProcessingGeneticEngineeringBioreaction EngineeringBioseparation Engineering生物分离技术的重要性 在基础研究领域， 生物分离技术的发展在某种程度上决定人类对生命、对自然的认知程度；在工业生物技术领域

3、，决定了生物产业的成本和经济效益。 生物工程的基本过程生产生产生物分离过程决定了生物产业的经济效益回收纯化过程成本占总生产成本的比例： 大多数酶：70 医用酶如天门冬酰胺酶：85 基因工程表达产物：85一90以上 青霉素：50 乙醇：14传统产品 小分子（少数工业用粗酶） 理化性质清楚 易于放大基因产品 大分子 胞内 不稳定 放大困难 生物分离过程的特点目标产物含量低 待分离物组成复杂稳定性差，容易失活对最终产品的质量要求严格 发酵液中：青霉素 4.2% 庆大霉素 0.2% 动物细胞培养液： 目标物含量 5 50 g/mlBack细胞组成（占干重百分比）类 型 蛋白质 % 核 酸 % 多 糖

4、% 类脂物 %细 菌 40-70 13-34 2-10 10-15酵 母 40-50 4-10 小于15 1-6丝状真菌 10-15 1-3 小于10 2-9藻 类 10-60 1-5 小于15 4-80动物细胞 小于10 小于50 小于50 小于50植物细胞 小于70 小于30 小于50 小于80Back 产物失活的主要机制是化学降解或微生物引起的降解。 影响因素包括： pH温度浓度蛋白水解酶等 要求：分离条件温和，并采用快速的分离纯化 方法除去影响目标产物稳定性的杂质。Back 目前对医药、生物制剂的要求：无菌、无热源，对于蛋白类药物，一般要求杂蛋白含量 2%。 例如： 对医用青霉素，噻唑

5、蛋白类的含量必须要 1.510-6； 原亲酶素和重组胰岛素，杂蛋白含量应 0.01%。 对有些产品还要求呈稳定的无色晶体 高效生物分离技术缺乏目标产物的回收率低 分离的成本高生物分离过程中存在的主要问题生物分离的一般步骤 破碎、萃取 沉淀、吸附 层析、色谱 超滤、冷冻干燥 离心、过滤 萃取、超滤 电泳 喷雾干燥、结晶粗提初分离精分离成品化目标产物回收率的计算每步的回收率： Yi = mi2 / mi1mi2 第i步分离后得到产品的总量， mi1 第i步分离前产品的总量总回收率： 分离原则提高每步操作的回收率减少操作步骤 对分离技术及设备进行系统研究，努力开发新型高效的分离纯化方法是实现降低目标

6、产物的成本、提高经济效益的必由之路。例如：对人干扰素的分离 总回收率：16%离子交换（62.7%)硫酸盐盐析(96.2%)铜亲合层析(46.0%)疏水层析（78.3%)凝胶电泳(88.9%) 仅三步产品的回收率就达到81%，且产品的纯化程度与上述纯化过程相当。 分离路径的选择非常重要！硫酸盐盐析免疫亲合层析阳离子交换层析如何进行分离方法的选择？方法：1 寻找差异 物理性质：重力，分子大小，溶解度化学性质：分子的亲疏水特性及其所带电荷性质的差异生物学性质：生物分子间的特异性识别作用 性质上最大的差异将导致最有效的分离2 对于生物活性物质，必须考虑分离方法对其生物活性的影响生物分离产品的类型：小分

7、子类：MW 1000，酶、抗体、重组蛋白、 核酸等.生物分离的理论基础利用分子间相互作用力的差异实现分离利用生物分子的化学和生物学性质的差异沉淀、萃取、吸附、色谱等利用分子间物性上的差异实现分离如分子量、沉降系数、挥发度等膜过滤、凝胶筛分、电泳、离心、蒸馏等生物分离方法及分离机理 单 元 操 作 分 离 机 理 分 离 对 象 举 例膜分离 微滤 压力差、拆分 菌体、细胞 超滤 压力差、筛分 蛋白质、多糖、抗生素 反渗透 压力差、筛分 水、盐、糖、氨基酸 透析 浓度差、筛分 尿素、盐、蛋白质 电渗析 电荷、筛分 氨基酸、有机酸、盐、水 渗透汽化 汽液相平衡 乙醇萃取 有机溶剂萃取 液液相平衡

8、有机酸、抗生素 双水相萃取液液相平衡 液液相平衡 蛋白质、抗生素 液膜萃取 液液相平衡 氨基酸、有机酸、抗生素 反胶团萃取相平衡 液液相平衡 氨基酸、抗生素 超临界流体萃取 相平衡 香料、脂质层析 凝胶过滤层析 浓度差、筛分 脱盐、分子分级 反相层析 分配平衡 甾醇类、维生素、脂质、肽 离子交换层析 电荷、浓度差（pH、 蛋白质、氨基酸、抗生素、 离子强度） 核酸、有机酸 亲和层析 生物亲和作用 蛋白质、核酸 疏水相互作用 疏水作用 蛋白质 层析聚焦 电荷、浓度差（pH） 蛋白质电泳 凝胶电泳 筛分、电荷 蛋白质、核酸 等电点电泳 筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸 等速电泳 筛分、电荷、浓度

9、差 蛋白质、氨基酸 区带电泳 筛分、电荷、浓度差 蛋白质、核酸离心 离心过滤 离心力、筛分 菌体、菌体碎片 离心沉降 离心力 菌体、细胞、血球 超离心 离心力 蛋白质、核酸、糖类了解分离产物的物性对分离过程的设计是必需的溶解度：受 pH、盐等影响，将指导沉淀过程或 萃取过程分子电荷：将指导如何有效地进行离子交换等分子大小：指导凝胶过滤和膜过滤疏水性：指导沉淀过程和疏水分离功能团：功能团为稳定条件、提取剂及亲和吸 附剂的选择提供依据稳定性：适宜的pH值范围、温度范围、半衰期挥发性：是小分子物质选择分离过程的依据生物物质常用的分离方法1氨基酸： 两性电解质，具有等电点，溶解度受溶液pH影响显著的特

10、点。 常采用的分离纯化方法 结晶离子交换2蛋白质和多肽： 特点：两性电解质，具有带电性、疏水性 和生物亲和性，分子量差异较大。 常用的分析方法： 离心 沉淀 膜分离 萃取：双水相萃取、反胶团萃取 层析 电泳等 3、糖类： 单糖、低聚糖、多糖 分离纯化方法以吸附层析为主4、脂质： 脂肪酸、不饱和脂肪酸、卵磷脂等。 分离纯化方法： 有机溶剂萃取 超临界流体萃取 层析等方法5抗生素： 分离纯化主要采用： 有机溶剂萃取 离子交换 结晶 吸附层折6其他 天然植物及中药中的药用成分。 分离纯化： 萃取：溶剂萃取和超临界萃取 吸附层析等工业生物分离过程选择的依据 对于生物产品，消费者更看重的是产品的价格、质

11、量和实用性。所以，工业生物分离过程选择的标准应该是以获得高质量、低价格的产品为目标。影响产品成本的除了分离步骤和效率外，还有一个重要的因素就是产品的浓度。 根据热力学第二定律，混合过程熵增大，是自发过程。所以，两种互溶的物质相互混合时，不需要外界能量。但是，要使混合的物质得到分离，必须补充使熵减小所需的能量。在恒温条件下使混合物中的各组分提纯为纯粹的物质所需的最小功 与吉布斯自由能变化 相等，即在稀溶液中： 即得到单位质量物质 所需的能耗与 成正比。所以，原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离回收的成本越大。 采取的方法：1）增加产品在发酵液或细胞内的浓度；2）将浓缩过程尽可能地放在分离的

12、最初阶 段。 分离效率的评价评价一个分离过程对目标产物的分离效率主要有下面三个标准：浓缩率 m（concentration factor)： 表征以浓缩为目的的分离过程的最重要指标分离因子 （separation factor or purification factor) 表征目标产物的分离纯化程度的重要指标回收率 R (recovery factor) FC FP 原料 产品 CTC，CXC CTP，CXP FW CTW，CXW 废料 其中，F表示流速，C表示浓度，下标T和X分别表示目标产物和杂质，C、P和W分别表示原料、产品和废料。浓缩率 mT = CTP/CTC mX = CXP/CX

13、C如果 mT = mX ，则目标产物未得到分离纯化分离器分离因子 =分离因子越大，分离效率越高回收率R R = 100% = 100%工业生物分离过程举例1 单克隆抗体的生产（monoclonal antibodies)用途：临床治疗、检测及实验研究生产规模： 1m3/day，小规模批量生产，属于高附加值 产品，反应器的体积一般为35L左右。类型：IgG：分子量160,000Da，能够分泌到胞外； IgM：分子量是IgG的5倍，存在于细胞膜表面。生产的方式：杂交瘤细胞生产的融合蛋白（血清培养）. IgG product Cells Supernatant IgG eluted Unbound

14、material 单克隆抗体的回收和纯化（John Wiley 等，1995）Bioreactor fluidwith cellContinuouscentrifugation100,000MWmembraneAffinitychromatograph Sterile filtrationFormulationMembraneconcentration2. 人胰岛素（human insulin)生产方式：基因工程 E.coli；以包含体的形式存在于胞内； 细胞培养产生的是胰岛素前体，需进一步进行 化学转化为胰岛素含量：小于1g/L（相当低）；用途：临床注射用，要求的纯度相当高；3. 狂犬病疫苗

15、（Rabies vaccine) 病毒性疫苗的生产一般是在动物体内、单层培养或悬浮培养，在病毒溶解细胞后在将其收集。生产方式：使用猿猴细胞作为微载体悬浮培养，反应体积 上百立升。动物细胞被固定在珠状的微载体上。 病毒（0.3m)首先感染细胞并在其内复制。其 后被收集分离。 Product Product B-chainCell debris A-chain SupernatantCyanogen 人胰岛素的回收和纯化Bromide （San Diego等，1998）Bioreactor fluidwith cellsPrecipitationChromatography阴离子、体积排阻Cell

16、 disruptionCentrifugal extractionDialysisCleaningpro insulinPrecipitationpH=5.0Chromatography弱阴、反向HPLCExtractionSulfonationDialysis狂犬疫苗的下游分离过程 （John Wiley等, 1994) Cells Permeate Concentrated virus -Propiolactone 丙酸内脂 4C 37 C HSA Nonantigenic material ProductBioreactor fluidwith cellsMembraneUF membr

17、ane10-100kDaVirusinactivationHydrolysis(24 hr)Zonal(蔗糖）Centrifugation 除菌青霉素（penicillin)：用青霉菌生产，主要提取步骤为萃 取。蛋白酶（protease)用途：洗涤剂，所以对纯度要求不高目的：高浓度、高产率，而非高纯度L-赖氨酸（L-lysine) 可用于动物和人使用，不同用途，不同的纯化方式。主要分离方式为吸附。柠檬酸（citric acid) 由Aspergillus niger（曲霉）生产，酸性菌，在低pH值下生长。主要分离方式为萃取（用煤油和叔氨）。青霉素的分离及纯化（Macmillan,1983) P

18、roduct CaCl andPolyelectrolyte T=5C Spent solvent Filtrate Spent IsopropanolAmyl acetate solvent or butanol乙酸戊酯 Extract Spent solvent Acetone and water andCarbon and sodium or Impurities potassium acetate Bioreactor fluidwith cellsFiltrationExtractionspH 2-3Activated carbontreatmentFiltrationDryingFiltrationWashingFiltrationPrecipitation 蛋白酶的分离纯化 （Shuler ML等, 1992) Solid Product Cool to 4-5CFilt