超高效液相色谱的发展背景-生命科学研究中心课件

1、UPLC应用技术简介生命科学研究中心现代分析检测平台目 录液相色谱历史回顾1仪器介绍与理论基础2HPLC与UPLC比较3应用和展望4色谱分离精度高，设备简单，操作方便，根据各种原理进行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析和检测，而且广泛应用于生物物质的制备分离和纯化。是目前最好的生物纯化技术。常见的分离方式蒸馏离心电泳过滤超滤色谱一、液相色谱历史回顾液相色谱40年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。由下图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。一、液相色谱历史回顾高效液相色谱法 HPLC(High Performance Liqu

2、id Chromatography ) 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器 广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业 无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间一、液相色谱历史回顾 自20世纪70年代以来，随着高效液相色谱(HPLC)技术的不断发展，美国Waters公司于2004年的匹兹堡会议上推出了最新研制的ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)，其采用17 m细粒径的新型固定相，可获得高达2万块m理论塔板数的超高柱效，并以系统整体设计的创新技术，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度，造就了

3、液相色谱性能上的飞跃和进步并形成分离科学的一个新兴领域。一、液相色谱历史回顾 超高效液相色谱的发展背景 首先是大量的样品需要在很短的时间内完成； 其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求； 第三是在与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。 将HPLC的极限作为自己的起点。 一、液相色谱历史回顾ACQUITY H-Class 系统总揽二、仪器介绍与理论基础检测器：光电二极管矩阵 为UPLC专门优化的流动池 高速检测色谱柱管理： 1.7细粒径新型固定相 液体加热器样品管理器： 低扩散 快速进样周期 低交叉污染 两个样品盘四元溶剂管理：四元梯度在线脱气UPL

4、C的耐压能力二、仪器介绍与理论基础技术上的突破:UPLC色谱柱技术二、仪器介绍与理论基础ACQUITY UPLC H-Class主动预热二、仪器介绍与理论基础二、仪器介绍与理论基础分离度速度容量开发液相色谱方法分辨率是色谱分离中主要考虑的因素在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下几个因素都要考虑。灵敏度载样量分析速度溶剂损耗三、HPLC与UPLC比较色谱条件的开发思路 根据分析物的化学性质选配色谱条件 基于既往经验及思考进行合理猜测 通常辅以资料参考 询问同事“步进式”测试开发 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行 系统性筛选策略 先按流动相pH、有机相和固定相的

5、直接组合进行系统性筛选测试o 评估结果，选择最有效的条件组合 再进行方法优化o 梯度/温度三、HPLC与UPLC比较 UPLCTM与HPLC：速度比较由于ACQUITY UPLCTM系统用1.7 m颗粒，柱长可以比用5 m颗粒时缩短3倍而保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了9倍而分离度保持不变。三、HPLC与UPLC比较三、HPLC与UPLC比较 能够在一个工作日内完成方法开发!一、对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行系统性筛查 二、高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨分离在更快的同时分离能力不打折扣三、可自动选择色谱柱和流动相四、 四元溶剂混合使方法开发更方便 UP

6、LC技术实现更快更有效的方法开发三、HPLC与UPLC比较使用UPLC的一般建议三、HPLC与UPLC比较三、HPLC与UPLC比较使用UPLC的一般建议新鲜流动相的要求三、HPLC与UPLC比较器具使用通则三、HPLC与UPLC比较方法转换考虑因素三、HPLC与UPLC比较UPLC和HPLC区别三、HPLC与UPLC比较Click to add title in here 超高效液相色谱的应用现状1.食品安全领域1.1农药残留物检测领域1.2食品添加剂分析检测中的应用农药残留分析属于微量至超微量分析范畴，要求检测仪器有非常高的灵敏度；同时，由于其具有种类繁多、结构复杂等特点，对检测方法的通量

7、和速度也提出了更高的要求。在农残分析检测中，UPLC与传统的HPLC 相比较，不仅在分离度、灵敏度和分析速度上得到较大提高，而且很大程度上减少了样品和试剂的消耗量，具有很好的应用前景。随着食品品种和添加剂种类的增加、多种添加剂的复配使用，迫切需要建立多种添加剂同时快速检测的方法。目前，HPLC 技术是食品添加剂检测的最常用方法；而较这一传统方法而言，在技术性能上拥有优势的UPLC 得到了更突出的应用。四、应用与展望2.药物开发领域2.1化学药品分析2.2中药药品分析在针对药物合成的分析方面，UPLC可实现随时快速准确检测合成过程中的中间体、副产物或降解产物等。Waters公司合成了17 pm颗

8、粒度的Acquity UPLC填料，减少了固定相表面残余硅羟基，因而在分析生物碱类样品时，流动相中只加入酸抑制剂，不需添加有机胺即可使其获得良好的分离。由于在流动相中避免了有机胺及盐的加入，可以在一定程度上降低质谱噪音、减少对质谱的污染，且使用的流速适合与质谱直接联用，无需分流，可以进一步提高检测灵敏度，为中药分析提供良好的平台。四、应用与展望3.其他领域农药残留物检测水质和环境监测化妆品质量控制.四、应用与展望 与UPLC匹配的色谱柱比较少峰面积的重复性欠佳 对高频检测仪器的需要超高效液相色谱的局限性尽管UPLC能显著减少复杂样品的分析分离时间，提高检测的灵敏度和分离度，但目前UPLC的使用

9、仍然存在局限性。色谱柱要能够耐受由于粒径减小而带来的高反压，而且粒径的减小也给色谱柱充填技术带来了挑战。UPLC分析样品时峰面积的重复性略逊于HPLC，特别是低浓度样品时更加明显，其峰面积重复性的RSD约为HPLC的2倍。UPLC分离样品色谱峰扩展很小，通常峰底宽度只有几秒钟，低浓度的样品峰则更窄。使用UPLC测定低浓度样品时，准确度、精密度都比较差。四、应用与展望四、应用与展望UPLC用于热毒宁注射液中11种成分测定及其指纹图谱研究 UPLC 法测定大鼠血浆中 Liguzinediol 浓度以及动力学研究色谱条件 色谱柱: Acquity UPLC HSS T3 柱( 2.1 mm100 m

10、m， 1. 8 m) ; 流动相 甲醇 : 水( 28 : 72) ; 流速: 0. 4 mlmin -1; 柱温: 30 ; 检测波长: 278 nm; 进样量: 5 l。 血浆样品处理方法 精密吸取血浆 200 l，置5 ml 离 心 管 中， 精 密 加 入 内 标 溶 液 20l 及 甲 醇1. 80 ml， 漩 涡 振 荡 3 min， 5 000 r min -1离 心 5min。精密吸取上清液 1.6 ml，45 水浴 N2 吹干，残渣加流动相 200 l 涡旋 30 s 使溶解， 10 000 rmin -1离心 5 min，取上清液进样。四、应用与展望UPLC 测定草莓果实中

11、类胡萝卜素含量以丙酮石油醚=12 作为提取剂，皂化提取草莓果实中类胡萝卜素，同时采用 ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱，以乙腈甲醇=91 为流动相，在 450 nm 下测定是进行草莓果实类胡萝卜素定性定量分析的最佳方法。 成熟草莓中能检测到叶黄素、-隐黄质、-胡萝卜素，含量依次为：118.5、12.6、99.8 gkg-1；检测不到番茄红素；检测可以在 5 min 内完成，比常规方法节约时间 70%左右；方法平均回收率达到 93.2%，变异系数为 1.32%1.86%。四、应用与展望风信子花瓣花色苷组成分析UPLC 分析条件：色谱柱为 ACQUITYUPLCBEH 的 C18

12、柱（ 2.1 mm 100 mm， 1.7 m）。柱温 45 ，流速 0.4 mL min-1，进样体积 3 L。流动相 A 液为 0.1%的甲酸溶液（ V 甲酸V 水 = 0.199.9）； B 液为含 0.1%甲酸的乙腈（ V 甲酸V 乙腈 = 0.199.9）。梯度洗脱程序：0 min， 95% A， 5% B； 0.5 min， 95% A， 5% B； 2.5 min， 82% A， 18% B； 7.5 min， 65% A， 35% B；11 min， 35% A， 65% B； 12 min， 0% A， 100% B； 13 min， 0% A， 100% B； 13.5 m

13、in， 95% A， 5%B； 15 min， 95% A， 5% B。在特征吸收波长 520 nm 处检测总花色苷（ totalanthocyanins,TA）含量。以标准品氯化矢车菊( cyanidin chloride，Sigma）作为外标，通过标准曲线法对对花瓣 TA 进行定量。 TA 为每 g 新鲜花瓣中含有的相对于 cyanidin 的含量四、应用与展望谷子茎尖组织中4种植物激素 赤霉素、-萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、脱落酸色谱柱：Hypersil C18（5m，200 mm4.6 mm）；柱温30；流速0.6 mLmin-1；进样量20L；检测波长254 nm；流动相：甲醇（A）-0.75%冰醋酸溶液（B）； 色谱柱：ACQUITYUPLCBEH 的 C18 柱（ 2.1 mm 100 mm， 1.7 m）。柱温 30 ，流速 0.4 mL min-1，进样体积 6 L。）检测