RNA干扰FOXM1基因抑制食管鳞癌细胞增殖 精灵论文

1、RNA 干扰 FOXM1 基因抑制食管鳞癌细胞增殖管国波，刘玮婧，戚玺君，王大巾，章小斌，赵辅昆，丁明浙江理工大学生命科学学院分子酶学与蛋白质组学研究室，杭州 310018摘要：目的：利用 RNA 干扰技术下调食管鳞癌细胞 TE-1 中 Fockhead box M1FOXM1的表达水平，探讨 FOXM1 对食管鳞癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：构建 3 组针对 FOXM1 基因不同位点的 shRNA 表达载体pLKO.1-FOXM1 shRNA 1，pLKO.1-FOXM1 shRNA 2，pLKO.1-FOXM1 shRNA 3，与病毒包装质粒pCMV-DR8.2，pCMV-VSV-G

2、共转染 HEK293T 细胞，包装病毒后侵染食管鳞癌 TE-1 细胞，利用嘌呤霉素筛选稳定株。 Western blot 检测稳定株 FOXM1 的表达水平，利用 MTT 实验和划痕实验分析 FOXM1 表达 水平下调对 TE-1 细胞增殖能力和迁移能力的影响。结果：测序结果说明成功构建了 3 个 FOXM1 干扰载体；Western blot 检测显示 3 个干扰载体抑制 FOXM1 表达的能力不同，其中 RNA 干扰组 pLKO.1-FOXM1 shRNA 2 的抑制效果最好；MTT 和划痕实验结果说明 RNA 干 扰组细胞的增殖能力和迁移能力有所下降。结论：体外实验证实下调 FOXM1

3、的表达可抑制 食管鳞癌细胞的增殖和迁移，这为进一步体内研究 FOXM1 在食管鳞癌发生和转移中的作用 提供了理论和实验依据。关键词： 食管鳞癌；Fockhead box M1；RNA 干扰；细胞增殖；细胞迁移中图分类号：Q513Down-regulation of FOXM1 by RNA Interference InhibitsProliferation of Esophageal Squamous Cell Carcinoma CellsGuan Guobo, Liu Weijing, Qi Xijun, Wang Dajin, Zhang Xiaobin, Zhao Fukun, Di

4、ngMing(School of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, HangZhou310018)Abstract: Objective: To investigate the effects of Fockhead box M1 (FOXM1) on the proliferation and migration of ESCC cells, RNAi was performed to specifically knock down FOXM1 expression inESCC cells, TE-1. Methods: Three

5、shRNA plasmids specifically targeting different sites of FOXM1 were constructed and transfected into HEK293T cells with pCMV-DR8.2, pCMV-VSV-G, generatinglentiviral particles and infected the target cell. Cells that stably express shRNA were selected by puromycin. FOXM1 expression was measured by We

6、stern blot. The effects of FOXM1 shRNA on cellproliferation and cell migration were examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and wound-healing assay. Results: Three recombinant plasmids targeting FOXM1 were constructedsuccessfully. The inhibitory effects of 3 shRNA plasmids varied, pLKO.1-FOXM

7、1 shRNA 2 group had the most best effect. As compared to pLKO.1-scramble group, the pLKO.1-FOXM1 shRNA 2 groupshowed lower proliferation. Furthermore, shRNA mediated knockdown of FOXM1 in TE-1 cells inhibited the cell migration. Conclusion: Down-regulation of FOXM1 could inhibit the proliferationand

8、 migration of ESCC cells in vitro, which provides an experimental evidence for further investigating its role in the development of ESCC in vivo.Key words: ESCC; Fockhead box M1; RNA interference; cell proliferation; cell migration作者简介：管国波1986-，男，硕士研究生，主要研究方向：肿瘤发生与相关信号转导途径通信联系人：丁明1979-，男，讲师，主要研究方向：分

9、子酶学与蛋白质组学. E-mail: HYPERLINK mailto:dingbiotechgmail dingbiotechgmail 0引言食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，食管鳞癌ESCC和食管腺癌EADC是食管 癌两种主要的类型，西方国家以腺癌为主，而包括中国在内的亚洲地区以鳞癌居多1。近些 年尽管外科手术切除法、化学疗法以及放射线疗法取得了一定的疗效，但是 ESCC 患者的预 后效果较差，5 年的生存率缺乏 15%2-3。随着分子生物学等学科的开展，人们逐渐认识到 肿瘤的发生是一个多因素作用、多基因参与，经过多个阶段才最终形成的极其复杂的生物学 现象，其中涉及到了遗传和表观遗传的改变

10、，如癌基因的激活、抑癌基因的失活以及细胞周 期生长因子的异常调节等诸多因素4。因此，深入研究 ESCC 的发病机制、寻找 ESCC 特异 性的肿瘤标志物，对于诊断和防治食管鳞癌、提高患者的生存率、改善患者的生活质量有着 重要的意义。Fockhead box M1FOXM1是 FOX 家族重要成员，它是细胞周期中重要的调节分子， 在细胞增殖过程中，FOXM1 调节细胞进入 G1/S 以及 G2/M，并且保证有丝分裂过程中纺锤 体的完整性5-6。研究发现，FOXM1 在乳腺癌7、肝癌8、肺癌9、胰腺癌10等恶性肿瘤组 织中表达量升高。当前的研究说明 FOXM1 可能是一种原癌基因，其高表达在某些肿

11、瘤的发 生、转移中可能起着重要的作用7-10，然而它与食管鳞癌发生和转移的关系尚不清楚。本研究通过构建 FOXM1 shRNA 表达载体，利用 RNA 干扰技术下调食管鳞癌细胞 TE-1 中 FOXM1 的表达水平，初步探讨 FOXM1 对食管鳞癌细胞增殖和迁移能力的影响，为进一 步研究 ESCC 的发病机制以及寻找 ESCC 潜在的治疗靶点奠定根底。1材料与方法1.1 主要材料与试剂HEK293T，TE-1 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；大肠杆菌 TOP10 以及质粒 pLKO.1 TRC、pLKO.1 scramble、pCMV-VSV-G、pCMV-DR8.2 由 A

12、ddgene 提供；Age购自 NEB 公司；EcoR、BamH、T4 DNA 连接酶购自 Takara 公司；FuGENE6 Transfection Reagent 购自 Roche Applied Biosciences；DMEM、RPMI 1640 培养液购自Gibco 公司；小鼠抗人 FOXM1 单克隆抗体、小鼠抗人 GAPDH 抗体、辣根过氧化物酶标记 的羊抗小鼠 IgG、四甲基偶氮唑盐MTT等购自 Sigma-Aldrich 公司。1.2 方法1.2.1FOXM1 shRNA 表达载体的构建根据 FOXM1 的 cDNA 序列设计 3 对 FOXM1 干扰序列表 1，阴性对照质粒

13、为 pLKO.1 scramble，shRNA 片段由上海英骏生物技术合成。每组干扰序列的正义链和反义链 退火后克隆到质粒 pLKO.1 TRC 的 Age和 EcoR位点上，转化大肠杆菌 TOP10，用含有 氨苄抗性的 LB 平板筛选，挑取阳性克隆，抽提质粒，用限制性内切酶 EcoR和 BamH双 酶切鉴定阳性重组子。对酶切鉴定正确的质粒进一步测序验证，测序正确的质粒命名为 pLKO.1-FOXM1 shRNA。表 1 FOXM1 干扰序列Tab. 1 The small interference RNA sequence of FOXM1名称干扰序列5-CCGGGCCCAACAGGAGTC

14、TAATCAACTCGFOXM1 shRNA 1 Forward oligoReverse oligo FOXM1 shRNA 2 Forward oligo Reverse oligoFOXM1 shRNA 3 Forward oligoReverse oligoAGTTGATTAGACTCCTGTTGGGCTTTTTG-35-AATTCAAAAAGCCCAACAGGAGTCTAATC AACTCGAGTTGATTAGACTCCTGTTGGGC-35-CCGGCGCCGGAACATGACCATCAAACTCG AGTTTGATGGTCATGTTCCGGCGTTTTTG-35-AATTCAAA

15、AACGCCGGAACATGACCATCA AACTCGAGTTTGATGGTCATGTTCCGGCG-35-CCGGGCCAATCGTTCTCTGACAGAACTCG AGTTCTGTCAGAGAACGATTGGCTTTTTG-35-AATTCAAAAAGCCAATCGTTCTCTGACAGAACTCGAGTTCTGTCAGAGAACGATTGGC-31.2.2细胞培养HEK293T 细胞用含 10% FBS 的 DMEM 完全培养基培养，食管鳞癌细胞 TE-1 用含 10% FBS 的 RPMI1640 培养基培养。传代时先用 PBS 洗细胞两遍，等 PBS 完全吸出后，参加适 量 0.2

16、5%的胰酶溶液于 CO2 培养箱消化 1min 左右，移至显微镜下观察。当细胞边缘发亮后 吸出胰酶，轻轻敲打培养皿侧面，参加 6ml 的完全培养基终止消化并轻轻吹打细胞，使细胞 分散成单个细胞存在，最后以 2105/dish 接种。细胞在 37，5%CO2 饱和湿度的培养箱中 培养。每 2-3 天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。1.2.3病毒包装和稳定株的筛选根据 FuGENE 6 转染试剂操作说明，将构建的慢病毒载体 pLKO.1-FOXM1 shRNA 1、 pLKO.1-FOXM1 shRNA 2、pLKO.1-FOXM1 shRNA 3、pLKO.1 scramble 分别与病毒包

17、装质 粒pCMV-DR8.2、pCMV-VSV-G共转染 HEK293T 细胞，收集转染 48h、72h 含有病毒 颗粒的培养基上清，4、1250rpm 离心 5min，向 TE-1 细胞培养基中参加 200l 病毒，侵 染 20h 后换成完全培养基，24h 后参加终浓度为 0.375g/ml 的嘌呤霉素进行筛选。以未侵 染的 TE-1 细胞作为对照，嘌呤霉素的用量以对照组细胞在 3-5 天内全部死亡为佳，每隔 2 天换含有嘌呤霉素的完全培养基继续培养，约 3-5 天即可传代培养用于后续实验的研究。1.2.4Western blot 检测 TE-1 细胞 FOXM1 的表达收集对数生长期的细胞

18、，用预冷的 PBS 洗涤细胞 3 次。每 10cm dish 加 0.4ml 裂解液50mM HEPESpH7.4，50mM 氯化钠，5mM EDTA-2Na，1% TritonX-100，10mM 焦磷 酸钠，50mM 氟化钠，使用前加 1mM 苯甲基磺酰氟，1mM 钒酸钠，5g/ml 抑肽酶，5g/ml 亮抑酶肽，5g/ml 胃蛋白酶抑制剂，刮取细胞，5s 间隔 5s 冰上超声 30s，12000rpm、4离心 30min，取上清，Brandford 法蛋白定量。取 30g 蛋白进行 12%SDS凝胶电泳 别离并转移到 PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉室温封闭 1h，参加 1:1000 稀

19、释的小鼠抗人 FOXM1 单克隆抗体，4孵育过夜。TBST 洗膜 3 遍，参加 1:15000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊 抗小鼠 IgG 二抗，室温孵育 1.5h，TBST 洗膜 3 遍后加 ECL 发光底物，室温孵育 1-2min， 暗室曝光，同时以 GAPDH 作内参。1.2.5Giemsa 染色观察细胞的形态取对数生长期的 TE-1 细胞，0.25%的胰酶消化后按 2105/dish 接种于 6cm dish 中，当 细胞集合度到达 50%，换成含有 8g/ml polybrene.的完全培养基，同时滴加 200l 的病毒 液。侵染 24h 后换成终浓度为 0.375g/ml 的嘌呤

20、霉素的培养基，培养 4 天后对各组细胞进 行 Giemsa 染色11，显微镜下观察细胞形态学变化。1.2.6MTT 法检测细胞的增殖能力当 RNAi 组pLKO.1-FOXM1 shRNA、阴性对照组pLKO.1-scramble细胞达 80%密度时用 0.25%胰酶消化细胞，用含 10%FBS 的 RPMI1640 培养液制成单细胞悬液；以每孔3x103 个细胞接种于 96 孔板中，每孔加培养液 200l，置于 CO2 培养箱中培养；培养一段 时间后，每孔参加 20l MTT 溶液5mg/ml，继续培养 4h 后小心吸掉孔内培养上清液； 每孔参加 150l DMSO，振荡 10min，使结晶

21、充分溶解；选择 570nm 波长，在酶标仪上测 定各孔吸光值。以细胞接种 1 天 4h 后 MTT 吸光值为起始点，以时间为横轴、吸光值为纵 轴绘制细胞生长曲线。实验重复 3 次。1.2.7划痕实验检测细胞的迁移能力取对数生长期的细胞，消化后接种于 12 孔板中，置 37细胞培养箱中培养，直到细胞 铺满整个孔。此时用无菌的枪头tips沿各孔中轴均匀划一道裸露的无细胞带，用 PBS 漂 洗划下的细胞 2-3 次，参加完全培养液继续培养。每隔一段时间在倒置显微镜下观察同一位 置的细胞迁移情况，拍照记录。实验重复 3 次。1.2.8统计学分析应用 GraphPad Prism 5 统计软件对数据进行

22、分析，结果以平均值标准差表示。组间 比拟采用单因素方差分析，P 0.05，48h RNA 干扰组 2 的增殖能力与对 照组相比存在显著的差异P0.05，72h RNA 干扰组 1 和 2 的增殖能力与对照组相比存在 极显著的差异P0.01，FOXM1 表达量下调抑制 TE-1 细胞的增殖。图 5 MTT 检测 FOXM1 的表达量下调后 TE-1 细胞的增殖能力Fig. 5 Down-regulation of FOXM1 inhibited cell proliferation measured by MTT assay注：* P0.05；* P0.012.5 FOXM1 表达量下调抑制 T

23、E-1 细胞的迁移为了检测 FOXM1 表达量下调后 TE-1 细胞迁移能力的变化情况，我们进行了划痕实验。 实验结果图 6显示，9h 后对照组细胞划痕两侧的细胞向裸露区域迁移的趋势较为明显，22h 对照组裸露的中间区域已经长满细胞，而 RNA 干扰组细胞的划痕仍然明显可见。由此 可见，FOXM1 表达量下调降低了 TE-1 细胞的迁移能力。图 6 划痕实验检测 FOXM1 的表达量下调后 TE-1 细胞的迁移能力Fig. 6 Down-regulation of FOXM1 inhibited cell migration measured by wound healing (scratch

24、) assay 注：: pLKO.1-scramble 100, 0h; : pLKO.1-scramble 100, 9h; : pLKO.1-scramble 100, 22h; : pLKO.1-FOXM1 shRNA 1 100, 0h; : pLKO.1- FOXM1 shRNA 1 100, 9h; : pLKO.1-FOXM1 shRNA 1 100, 22h; : pLKO.1-FOXM1 shRNA 2 100, 0h; : pLKO.1-FOXM1 shRNA 2 100, 9h; : pLKO.1-FOXM1 shRNA 2 100, 22h; : pLKO.1-FOXM

25、1 shRNA 3 100, 0h; : pLKO.1-FOXM1 shRNA 3 100, 9h; : pLKO.1-FOXM1 shRNA 3 100, 22h3讨论FOXM1 转录因子是 FOXForkhead Box家族的成员，FOX 蛋白是进化过程中保守的 转录调节分子，它们的共同特征是含有约为 100 个氨基酸组成的 DNA 结合域又称为 FOXForkhead box结构域，它是由 3 个螺旋、3 个片层以及 2 个翅膀状winged的 大环结构组成12。FOX 蛋白在生物体的生长、发育过程中起着重要的作用，包括生物体的 新陈代谢、发育、分化，细胞的增殖、凋亡、转移和侵染等7。F

26、OXM1 是细胞周期中重要 的调节分子，它调节细胞进入 G1/S 以及 G2/M13。研究发现 FOXM1 在胚胎组织中有所表 达，而在终末分化的细胞以及非分裂细胞中不表达5，但在乳腺癌7、肝癌8、肺癌9、胰 腺癌10等恶性肿瘤组织中表达量升高，FOXM1 在肿瘤的发生开展中可能起着重要的作用。 然而 FOXM1 与食管鳞癌的发生和转移的关系仍不清楚，FOXM1 对食管鳞癌细胞增殖和侵 染能力的影响如何？在食管鳞癌中以此为靶点进行干预，它又会产生怎样的生物效应？目前 国内外尚没有报道。本研究利用 RNA 干扰技术下调食管鳞癌细胞 TE-1 中 FOXM1 的表达水平，构建了 3 株 FOXM1

27、 表达下调的 TE-1 细胞，初步探讨 FOXM1 对食管鳞癌细胞增殖和迁移能力的影 响。实验结果说明：FOXM1 表达量下调可降低食管鳞癌细胞 TE-1 的增殖和迁移能力，此 结果与相关的报道一致7-10。这些工作为进一步探索 FOXM1 在食管鳞癌细胞增殖和迁移中的具体分子机制奠定了根底，为体内研究 FOXM1 在食管鳞癌发生开展中的作用提供了理论和实验依据。参考文献 (References)1 Daly JM, Fry WA, Little AG, et al. Esophageal cancer: results of an American College of Surgeons P

28、atientCare Evaluation StudyJ. J Am Coll Surg, 2000, 190(5): 562-572.2 Jemal A, Murray T, Ward E, et al. Cancer statistics, 2005J. CA Cancer J Clin, 2005, 55(1): 10-30.3 Kong D.-C., Du X.-L., Wang M.-R. Protein alterations in ESCC and clinical implications: a reviewJ.Diseases of the Esophagus, 2021,

29、22: 920.4 Mandard M, Hainaut P, Hollstein M. Genetic steps in the development of squamous cell carcinoma of the esophagusJ. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 2000, 462: 35342.5 Uppoor G. Bhat, Marianna Halasi, Andrei L. Gartel. Thiazole Antibiotics Target FoxM1 and InduceApoptosisin Human Cancer CellsJ. PLoS ONE. 2021, 4(5): 1-7.6 Stephen S. Myatt, Eric W.-F. Lam. The emerging roles of forkhead box (Fox) proteins in cancerJ. NatureReviews Cancer, 2007, 11(7): 847-859.7 NuranBektas, AnettetenHaaf, JrgenVeeck, et al. Tight correlation between expression of the Forkhead transcri