实验九脲酶波氏比色法测定血清尿素

1、1实验九 脲酶波氏比色法测定血清尿素实验目的1、掌握该方法的原理和操作2、了解影响实验结果的因素 23概述 非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。其中尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作为肾小球滤过功能的指标。 4检测尿素的方法分两类1、直接法（二乙酰一肟法） 利用二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。 本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达到100，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。 5 2、脲酶法 是直接或间接测定经脲酶

2、作用后由尿素转变成 的氨，氨的测定方法有：1) 利用电导电极测量导电率的变化。2) 利用pH电极或pH指示剂测量反应前后pH 值的变化。3) 波氏法。4) 偶联谷氨酸脱氢酶340nm测定吸光度下降 率。5）干化学法。6 一、原理：脲酶水解尿素产生2分子氨和1分子二氧化碳，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在550nm波长处有吸收峰。 脲酶波氏比色法 4、 尿素标准液 7.14mmol/l7 三、操作步骤： 按下表操作。 脲酶应用液预温5分钟 加入物(ml)测定管1、2标准管空白管脲酶应用液0.50.

3、50.5血 清0.01尿素标准液 0.01无氨去离子水0.01混匀，37水浴15min酚显色剂111碱性次氯酸钠111混匀，置37水浴20min。波长550nm，空白管调零，读取吸光度。 89结果计算10参考范围 1.79-6.78 mmol/L。 11临床意义 1血液尿素浓度增高 分生理性和病理性因 素两方面。(1) 生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高0.30.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。12(2) 病理因素1) 肾前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致

4、血液尿素浓度增加。2) 肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。133) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。2血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。14注意事项 本法亦能测定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多1000多倍，因而测定尿氨时，氨必须经过校正，可测定用脲酶处理前尿标本中的氨以校正内源性氨。空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。1

5、5大气及试剂用水中的氨可明显干扰尿素的测定，使结果假性增高。酶工作液接触大气8d后，测定值上升1.07mmol/L；去离子水明显吸收氨，使测定值明显升高。胆红素在34.2mol/L以上时尿素测定值有不同程度的降低，在25.6568.4mol/L之间时，平均降低0.47mmol/L，但与胆红素含量不成正比。 16方法学评价 1呈色稳定性 在1h内吸光度的波动仅为0.005，12h后较最初吸光度读数也仅增高0.010.02。2本法批内CV1.8%，批间CV2.7%；回收率96.71%103.35%；与酶偶联法对照测定病人标本37例，相关系数(r)为0.972；线性范围较宽，达17.58mmol/L

6、。17试剂标准化尿素酶对不同缓冲液的最适PH不同Chaney的配方最适pH为6.5，美国临床化学协会推荐的配方最适pH为7.5。酶浓度的选择 每管3U酶量在温育3分钟及6分钟均能达到终点。试剂稳定性观察 尿素酶干粉4保存至少稳定一年，但甘油溶液稳定性较差；催化剂剂量对酶活性的影响 最适为50mg/L，量过多对酶有抑制作用 18二、酶偶联速率法 原理：尿素经脲酶催化水解生成2分子氨及1分子二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶催化下，氨与-酮戊二酸还原型辅酶作用生成谷氨酸与氧化型辅酶。还原型辅酶在340nm波长处有吸收峰，其吸光度下降的速率与待测样品中尿素的含量成正比。19方法评价1本法批内CV 0.78%，批间CV 2.94%；回收率93.0