课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)脲酶+ CO2NH3+ H2O3、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路（一）筛选菌株（二）统计菌落数目（三）设置对照 1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存 环境的要求，到相应的环境中去 寻找。原因：因为热泉温度70800C，淘汰了 绝大多数微生物只有Taq细菌被 筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种

2、在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。（一）筛选菌株人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。什么是选择性培养基？ 2、实验室中微生物的筛选原理：15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分

3、解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种目的结果只生长尿素细菌生长多种微生物是 5、怎样证明此培养基具有选择性呢？1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：（二）统计菌落数目2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌

4、落 是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。注意事项：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中， 经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）设置对照实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应 的106倍稀释

5、的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样 的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：土样不同， 培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是 必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为 空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同， 则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。（一）土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取

6、土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。（二）制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。二.实验的具体操作应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行（三）样品的稀释实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、 培养物等。（四）取样涂布分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数目的细菌104、105、106保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板放线菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗

7、漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。（五）微生物的培养与观察如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。微生物的培养与观察1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，

8、如相差较大，表示实验不精确。三.结果分析与评价无菌操作 做好标记 规划时间 四.操作提示在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。五.课外延伸大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 本课题知识小结:对细菌群体生长规律测定正确的表述是（ ） A在液体培养基上进行 B至少接种一种细菌 C接种一个细菌 D及时补充消耗的营养物质解析：细菌

9、群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。A六.例题解析1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A. 在液体培养基上进行 B. 至少接种一种细菌 C. 接种一个细菌 D. 及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（ ） A. 培养细菌 B. 培养真菌 C. 使需要的微生物大量繁殖 D. 表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A. CO2和N2 B. 葡萄糖和NH3 C. CO2和尿素 D. 葡萄糖和尿素实践训练A CD4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5， 以M3作为