药物分析 第9章 甾体激素类药物分析

1、药物分析 第9章 甾体激素类药物分析多氢菲菲环戊烷甾体激素的基本母核多氢菲并环上双键的表示方法： 用“”表示，双键的位置写在的右上角。双键位置环上取代基构型表示方法： 构型：与母核连接的取代基，指向环平面的前面时，为构型，用实线表示“” 构型：与母核连接的取代基，指向环平面的背面时，为构型，用虚线表示“” 4 5 1,4 5(10) 椅式全反式刚性骨架 最稳定面下键： 键面上键： 键 处于 平伏键的取代基空间位阻小，易受试剂进攻， 直立键受角甲基位阻的影响，试剂难以进攻。C11位的直立键受两个角甲基的双重影响，最难被试剂进攻。以下主要基团可供分析：1.4-3-酮，C20酮基DABC123456

2、7891011121314151617181920212.C11： 或3.C17：，环上的酚羟基5.卤素(-F)，酯基 甾体激素(1) 肾上腺皮质激素(氢化可的松、泼尼松、醋酸地塞米松、曲安奈德)(皮质酮)(2) 雄性激素及 蛋白同化激素 (苯丙酸诺龙)(睾酮)(3)孕激素(黄体激素)(黄体酮)(4)雌激素(卵泡激素)雌二醇炔雌醇氢化可的松 hydrocortisone 又名：可的松;皮质醇;氢化皮质酮;氢可的松 (1)肾上腺皮质激素C17 -醇酮基-3-酮 -3-酮 C17 -醇酮基还原性UV羰基试剂反应IR与羰基试剂反应氢化可的松 hydrocortisone 可的松-3-酮 C17 -醇

3、酮基（皮质酮）（corticosterone）-3-酮 C17 -醇酮基氢化泼尼松： 在氢化可的松结构上1，2位间引入双键 C17 -醇酮基-3-酮 醋酸地塞米松-3-酮 C17 -醇酮基916醋酸地塞米松主要结构特征（1）含有21个C ，A环4-3-酮结构（,-不饱和酮），有紫外吸收 （2）D环的C17上-醇酮基，有还原性。 （3）10位、13位-甲基， 11位羟基、羰基等受立体效应影响， 无利用价值；人工合成品：1、2位间有双键，6，9位引入卤素，16或16位引入甲基，16位引入羟基。（2）雄性激素及蛋白同化激素 睾丸素的衍生物 C17 b羟基-3-酮 雄性激素-3-酮 （睾酮 testo

4、sterone）甲睾酮丙酸睾酮-3-酮 丙酸睾酮蛋白同化激素（苯丙酸诺龙）（nandrolone phenylpropionate）在睾丸素基础上结构修饰得到，如雄性激素及蛋白同化激素结构特点： 雄性激素母核含有19个C，蛋白同化激素的C10位无角甲基，母核含有18个C，A环的4-3-酮，有紫外吸收；C17位b羟基或由它们形成的酯 （3）孕激素甲酮基与亚硝基铁氰化钠反应孕酮黄体激素（黄体酮）（progesterone）-3-酮 17（黄体酮）（progesterone）供分析官能团：含有21个C ， A环的4-3-酮结构有紫外吸收；D环的C17上有甲酮基 （四）雌激素苯环UV，与重氮苯磺酸盐反

5、应卵泡激素（雌二醇）（estradiol）3雌激素乙炔基（炔雌醇）（ethinylestradiol）Ag+雌酮含有18个C，A环为苯环，3位上有酚羟基，D环17位：b羟基、-乙炔基可供分析结构特征：A环的C3-酚羟基及17位羟基。雌激素的结构特征口服避孕药，如炔诺酮、异炔诺酮、安宫黄体酮等 炔诺酮（norethisterone）异炔诺酮炔诺孕酮（norgestrel）A环有4-3-酮结构； 有的第17位有羟基和乙炔基； 第10位无甲基。 甾体激素 碳原子数 A环 17位取代基 肾上腺皮质激素 21 4-3-酮 C17-醇酮基或羟基雄性激素 、同化激素19 4-3-酮 -OH；-CH3 孕激素

6、 21 4-3-酮 甲酮基 雌激素 18 苯环、C3-酚OH -OH ；-CC 乙炔特殊官能团情况甾体激素类 药物鉴别(1)呈色反应A.与强酸呈色反应 B.官能团呈色反应(碱性四氮唑蓝试液、硫酸苯肼、亚硝基铁氰化钠等)(2)沉淀反应A.斐林试剂反应 生成Cu2OB.银氨溶液反应生成AgC. AgNO3溶液反应生成AgCl(3)衍生化反应(生成酯、肟、缩氨基脲等)(4)水解产物反应(如醋酸可的松用EtOH制KOH及H2SO4使生成醋酸乙酯的香气鉴别)(5)UV法(6)IR法(7)TLC法(8)HPLC法炔雌醇 和黄体酮 250)制衍生物测熔点与硫酸的呈色反应橙红黄绿荧光絮状玫瑰红H2O甾体激素母

7、核能与H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl等强酸呈色。 最常用的是H2SO4。炔雌醇 IR33003000cm-119001650cm-137503300cm-1衍生化反应炔雌醇m.p.201黄体酮双肟m.p.238官能团呈色反应(1). C17-醇酮基的呈色反应：具还原性、能与氧化剂碱性酒石酸铜试液、氨制硝酸银试液、碱性四氮唑试液反应而呈色。(2). 酮基的呈色反应：C3-酮基和C20-酮基均能与异烟肼、2,4-二硝基苯 肼、硫酸苯肼等羰基试剂呈色。(3). 甲酮基的反应：亚硝基铁氰化钠反应是黄体酮类专属鉴别方法， 在一定条件下，黄体酮显蓝紫色，其他常用甾体激素不显色或显淡橙色。(6)

8、. 有机氟的呈色反应：含氟药物破坏后，与茜素氟蓝及硝酸亚铈起 呈色反应。(4). 酚羟基的呈色反应：雌激素类C3位酚羟基与重氮苯磺酸反应生成红色偶氮染料（5）炔基的沉淀反应 遇硝酸银试液生成白色炔银沉淀(7). 酯的反应：甾体激素多以羧酸酯类用药 水解 游离羧酸 产生羧酸 特臭。醋酸可的松用EtOH制KOH及H2SO4使生成醋酸乙酯的香气鉴别肾上腺皮质激素类药物特征反应。 -醇酮基有强还原性，与氧化剂作用，被氧化成水合醛。 C17 -醇酮基的还原性TTC：氯化三苯四氮唑（又叫红四氮唑RT） BT：蓝四氮唑 用于肾上腺皮质激素类药物鉴别和含量测定。 三苯甲瓒氯化三苯四氮唑 （TTC）H深红2,3

9、,5-Triphenyltatrazolium chlorideRed tatrazoline RT(Formazan)与碱性酒石酸铜的反应Cu2O红斐林试剂与异烟肼的反应C3-酮基C20-酮基H+（缩合）羟胺 、氨基脲、异烟肼、硫酸苯肼2,4-二硝基苯肼如醋酸可的松、氢化可的松等，其甲醇或乙醇溶液加新制的硫酸苯肼试液，加热显黄色。甲睾酮异烟肼异烟腙与异烟肼的反应与亚硝基铁氰化钠的反应其他甾体激素橙色或不显色具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类C17甲酮基黄体酮蓝紫色间二硝基苯、芳香醛黄体酮本反应是黄体酮的灵敏、专属性鉴别反应活泼次甲基反应（Zimmermann 反应） 羰基邻位的次甲基叫活泼次

10、甲基。 羰 基 C3、C11、C20 次甲基C2、C12、C21羰基 C17 次甲基C16 雌酮 可的松间二硝基苯雌酮 有机氟化物的反应蓝紫NaOH硝酸亚铈茜素氟蓝F-蓝紫色与硝酸银反应乙炔基的反应白炔雌醇与硫酸的反应H2SO4醇制香水解反应 特殊杂质 检查(1) 游离磷酸盐(加钼酸比色测定)(2)有机溶剂残留甲醇和丙酮(GC法检查)(3)乙炔基 雌酮(炔雌醇中)目视比色(4) 硒氧瓶燃烧后用盐酸羟胺还原，UV法测A(5)其他甾体：TLC高低浓度对 照法(碱性四氮唑蓝试液显色) HPLC法不加校正因子的主成分自身对照法杂质检查游离磷酸 原理： 硒来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢剧毒原理处

11、理 其他甾体 与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体”特殊杂质检查来源原料、中间体、异构体、降解产物方法*TLC法（高低浓度对比法）*HPLC法（主成分自身对照法)特点*可能存在多个其他甾体*结构类似地塞米松磷酸钠中其他甾体检查 采用AgNO3-NaOH滴定法 电位滴定法 指示电极：玻璃电极参比电极：饱和甘汞电极(玻璃套管内装 饱和KNO3液)电极系统：玻璃-KNO3盐桥-饱和甘汞药典附录中表示： 中氢置换法“乙炔基”的检查(1)UV法(2)GC法(3)HPLC法(4) 四氮唑比色法皮质激素C17-醇酮基(COCH2OH)具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色物，再测A

12、值。(5)异烟肼比色法甾体激素C3-及别的位置上酮基都能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合形成黄色异烟腙，在一定波长下有最大吸收。(6)Kober反应比色法 雌激素与H2SO4EtOH共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在515nm附近有最大吸收。H+甾体激素药物 含量？异烟肼法(Isonicotinic acid hydrazide)INH4-3-酮Isonicotinic acid HydrazideC3酮基及某些其他位置上的酮基能与羰基试剂异烟肼在酸性条件下形成黄色异烟腙，在一定波长下具有最大吸收，可用于定量。反应条件 （1）溶剂：无水乙醇，无水甲醇 （2）酸的种类、浓度及

13、异烟肼的浓度 常用HCl HCl：异烟肼=2M:1M时，获最大吸收度。 HCl浓度： （1000ml醇中含浓HCl） 异烟肼浓度：0.0365mol/L (0.5mg/ml) 甲睾酮异烟肼异烟腙 甾体激素与异烟肼的缩合反应为可逆反应，所以含水量升高可促使反应逆转而水解，使吸收度降低（H2OA） 在该反应条件下， 对43酮具有一定的专属性 C20酮基反应慢， C17酮基反应慢； C11酮基不反应 43酮：室温下，30反应完全Kober反应比色法炔雌醇片 Kober反应缺点： （1）条件较难控制，易出双色黄+红 （2）重现性较差： 呈色强度和稳定性受试剂浓度、组成、反应时间和温度的影响。 甾体激素

14、提取物中其他物质及制剂中稳定剂，赋形剂,溶剂对测定有干扰。 515第二步反应465450 500 550nmAKober 反应吸收光谱第一步反应 采用本法测定炔雌醇片及复方炔诺酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮片中的炔雌醇的含量中国药典含量测定特点 用样量少，灵敏度高，分离效果好，快速RPHPLC 各国药典常采用 可消除其他甾体的干扰中国药典2005年版 内标法 + 校正因子填充剂 C18 流动相 甲醇-水（70：30）醋酸地塞米松内标 甲睾酮炔雌醇内标 醋酸甲地孕酮黄体酮内标 己烯雌酚丙酸睾酮及其注射液内标 苯丙酸诺龙醋酸地塞米松片UV法皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素-3-酮 240nm（）苯环 280nm（）雌激素 醋酸地塞米松注射液四氮唑比色法常用的四氮唑盐I. 氯化三苯四氮唑（TTC） 也称红四氮唑（RT） 深红II. 蓝四氮唑（BT） 暗蓝 皮质激素C17- -醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲瓒。1、原理三苯甲瓒氯化三苯四氮唑 （TTC）H深红2,3,5-Triphenyltatrazolium chlorideRed tatrazoline RT(Formazan)对照品法2、测定方法4045暗3、测定条件（1）基团影响：一般认为：C11上的酮基反应速度快于C11位上的羟基，C21上的羟基酯化后较其母体羟基的反应速度慢