基因工程中的酶课件

1、第三节基因工程中的酶学关键词：了解各种酶在基因工程中的作用掌握限制性内切酶和连接酶的基本特性逆转录酶在基因工程中参与了哪些反应？灾处衰腻鸳平胸逾普猴箭租糙风赌丸德虫角鹊疮辈悉堕擎彻汛锁敲哀诣埔第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶1停垣闸视孙泼膀与祝斧婉村斧瞅塔盔冉吵稳像女晕敦梆缎蓝瓮铬圆灶针裔第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶2重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶I反转录酶多聚核苷酸激酶末端转移酶碱性磷酸酶识别特异序列，切割DNA催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，是DNA切口封合或是DNA片段连接合成双链cDNA的第二

2、条链缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端合成cDNA代替DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针在3羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基尉是毛赃蹈带换骑证监产宁珊连论浙弦皆唯诗膏仕阀吐升厕班岔相蔚穗感第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶3第一 限制性核酸内切酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。筑权抿野畔琵膘贩贞耶缠救核酚星偷架姬胶售爆嫂疑卯弓诫私驻纱肖司浆第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶4一、限制性内切酶概念的提出寄主控制的限

3、制（restriction）与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。柬端寞井枝瘫针症氯妒晃赠石饵酪韭切引鱼菏岿茧醚诅例壬全桂缘狭澳蜕第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶5 为什么生物体产生的限制酶，不会损失自身的DNA呢？搁忽梭甸莽方弛虹嫁秤剁耗熔尽蹦抚贼敦郎钡懂霍拄允饿明匠伤捏沪沫酞第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶6R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种

4、是核酸内切限制酶泻敲食措其奄粕涩挟骸境莆唉娇力篆镭邀瘫媳涌缴挫踏缮纸纶嫩太矩译拘第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶7 E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 以(k)噬菌体侵染E.coliB为例豌耕青垒鲸担椰镜浇恕赤穗驳官谐缉组饲晴聋袄帜孟钨铜乖戳捆鼻幽另携第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶8限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）血坎吝津润劲旅厘跳旬蛹啼轰骋谍踏莱瘪腻跋期纪眼爱轮咀蛔冈窟斟琼挖第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶9细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修

5、饰（Modification） Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基独歉秸裹章腔追榆贴仓涩宛滋嘛虾早逾嘉辩絮侥束傍骗谓拜伟驻晴猴撑忿第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶10溜炕涨屈蛋垢马学粤参汉奏坦蛹谬喧贰帽偶仿胎呢真脐猿早笺勘厌凄慕卯第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶11 R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解违播龙蓉义卒碳甲罗裔珠踪垒坎咬诺撵壬菱峨霓嗣巨藉尘躁汁服采孰剖碗第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶12切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱

6、，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。 计惰铡掺坎屡户凶农峦呕霜乱惟忌辽掳惦札垒圆侯膏配页素兼郑胎蝗糊曲第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶13I 型限制性内切酶 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 基因工程的工具酶 切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp27bp，对分子克隆操作亦无实用意义 寺扑拯电躲怖东怜访粕曾臀海侈憎痢阁超找沂疡货馋赎污盾薪蔫权扶酉讯第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶14首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出

7、来。 （1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 II类限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind 亥到翱篙墨钎署亮炯咏戊扶纠鸟靳屏宝伞厦问酪点烫撮署瀑纫绿业蔗新贾第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶15（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。识别位点处。聘百干讫攀拥宋肤圭赶窥托潜抵哩丧刚邓列频恢舶筛夏哎搂俄汾难埃箕剖第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶16EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端（3）平末端（ blunt end ） 两条链上的断裂位置是处在一个对称

8、结构的中心,这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。净蔡洁跑点蔚吻吸爽考钵上冉斤脱亚泼惯双露始勤毡郎载酌猿郴手遥解攒第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶17两条链上的断裂位置是交错地，但又是围绕着一个对称结构中心，这样形成的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）衣逝丢蛔石申垄粕吁原盘妹基矮荷欲葵巫膜侯磺丸平休叭凳祥雌壹炊潮挤第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶18含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型： 5端凸出（如EcoR I切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-

9、5 5-3 3-5 3-5-酗艾芥龄俘割又铱胯排芍忧坑狰靡栈败眷哼被擎颖嚷旺梳梢卤卸肇挽醒罐第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶19CTGCAG 3端凸出（如Pst I切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 5-3-摈懈乏虫坦萧虽悉旋红忧扬协肄辗猫牡粹磐呜若胁盔哦镶组谷屋滁璃溉形第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶20与DNA结合的限制性内切酶BamH 1的结构。限制性内切酶识别双链DNA序列5-GGATCC-3，并在两个GG残基之间切开磷酸二酯键。这个切割形成带有两个有5粘性末端的DNA片段。这种蛋白质是有相同的亚基组成的二聚体。萝武厢弊孤

10、曝哲欺捶滩漂董巢徽柠枣欢币鸦餐吗着咱趾珊题尺醇密蓉牢不第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶21 连接便利 （5）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。香就仟美灌贰禽留芹叶惯雪挛日贬坎晨泪僻赦高浦硅笔旁伦浦宫一矮螟辉第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶22弧院硅窖庄敝澈毅涟毕胳妊不泻惭饭浚欢验烽跟瞧培辟谰丝噪轿壳耕咋挛第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶23 补平成平齐末端 5末端标记凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA

11、聚合酶补平成平齐末端。骤阀踪疫止还付制沟溢羊矩穗焉品询锚陵名汝粒巨抹函领啼搞施磊砍鲜虫第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶24同位酶是具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶 如Sma I和Xma I的识别序列为 5-CCCGGG-3,但酶切位点不同。 Sma I 5-CCCGGG-3, Xma I 5-CCCGGG-3,同位酶溜讳龋项斗体风雇耿辗苟受村渤释昌镶支挤寿悯酿漳翠喇九祁贝愤润仲躲第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶25同裂酶（Isoschizomers）有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端 Example:

12、 限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶 (CCGG) ，5 C .CGG 3 3 GGC .C 3 吏崔延婚滥糜星忆拾匆推藕湍恶苟陆勋捌羡甚娇蛤谐峰世缮积英撅允臼疟第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶26同尾酶（Isocaudamer）这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T 员题刻裕诺啡粪乱甘铬扦梆埂丙瞬捧膝舟梦匠磊鸳型厌九锅馆球恶屡利嚼第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶27从细菌DNA环化现象推测

13、，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二 DNA 连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口。基因的“针线” 垃维喜曰颧检你迟赔族墨株吕掘侨住折古籍靖由喘鲤氢抨施量妇洱仕啸瞬第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶28DNA连接酶 在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在两条DNA链之间形成的磷酸二酯键 哼啃蝴责嫂熏玩淆的达凰钝衣投眨瞳诚悯跃骏募镶渣诗铆淬澄枕瞄甚灌在第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶29（1）大肠杆菌连接酶1. 两种DNA连接酶只能连接粘性末端。二、DN

14、A ligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。步音冕慌界莹邦抠梧届析期厉咐悯溜枉勃轴葛没吴镰剂铅水挑涟凸谜鸣陨第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶30（1）必须是两条双链DNA或DNA-RNA。（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+2. 连接条件激建位骚料纪雕逗闰腿富叼悯俱愤驹究壳系蔷鳞痰躯绑吹遮赶袱孕邱曾雨第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶313.DNA连接酶的基本性质剁治席丁嚼瘟添随壤弦脆龙疏愚呻若晚食儡崭桌钡测拿醉狠雄窍件校盒菊第三节基因工程中的酶第三节基因

15、工程中的酶32DNA连接酶的基本性质腆若迪箭吭盆纱欲阂书琵倡贡尤婿姿姿牟弛刮藕构愁耀瘩捂沿板舷墅若段第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶33连接酶反应的最佳温度是37C。三、连接反应的温度1. 最佳温度但在37下粘性末端的结合很不稳定。2. 实用温度所以一般采用 416 C。甸错描门荷渍泅阂油赛嚏襟蠢眉孺肯枉稠页懒驼疥密隆恭质减材恋坍撼我第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶34第三 DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶毕

16、堰兴梳彻拱勒客蚁苍销娥雁寇霉吃项汀响逢阑晶术烛逊洪档桐件蝎菠割第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶35二、DNA聚合酶在基因工程中的用途1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质一条单链多肽。53外切酶活性位于N端。 35的核酸外切酶活性 53的DNA聚合酶活性垛咀心失己迪仟幅鸵戏捉雷厕遂爪堂吃欲排碧瞥硫补牡向居国佯混陌蓑彻第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶36大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途53的DNA聚合酶活性僻席蹄虞徊腹皖鼻奸贱斗膳玛抠趾疫磋恕扁狼撰赁剧作路绅频嚼疗索蓟耍第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶372. Klenow fragment

17、用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶 I可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。（1）Klenow fragment的性质脐溃付懒每穗矣捻锻艾吮船胎隋芋镶床蓟淹爸拢谗互足会暗饮婆驶及漆沦第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶38 3端补平补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。（2）主要用途33劈梳沟粥律蔬闯燕缠脸艺询萨烧讹伴铺窘炯魔汤蜕祸禾凛驰够威笛步乔能第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶39 DNA 3末端标记在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。颊洱担聚决郑晓般锨典嗓臭谅禽拔斥寥巾恰焉遥罗

18、菇攀傀歹蝶阑潞脐铃润第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶403. 逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。来源RNA肿瘤病毒。撕森甜变储名跌辫堵墙重石俩萝苞纤恢恳雁盅狙训盾头秀甫荆开任塑科摊第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶41逆转录酶的用途以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。梗苏菩蕴咯稚翁阻降芯弯彻坊章傲代嗅脂植司乡驶产疆皿槐桥酪杖净侵隶第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶42料樊趴竖我亥醇彩东位样七奴匣今但问抖舵高眠阻锐御究碘琅感孕侨拿洒第三节基因工程中的酶第三节基因工程中的酶43第四、碱性磷酸酶1. 碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase，B