生物技术制药第2版-第三章-动物细胞制药

1、第三章 动物细胞工程制药参考教材1.生物技术制药 夏焕章 高等教育出版社2. 生物技术制药王凤山 人民卫生出版社3. 生物技术制药概论姚文兵 中国医药科技出版社22022/8/3第一节 概述第二节 动物细胞的体外培养第三节 动物细胞的培养条件和培养基第四节 动物细胞培养的基本方法第五节 生产用动物细胞的要求和获得第六节 动物细胞大规模培养的方法和操作方式第七节 动物细胞生物反应器第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求第九节 动物细胞制药的前景与展望本章内容2022/8/33学习要求：掌握：动物细胞培养的基本要求、培养基的种类及主要组成；生产用细胞的要求及获得方法。熟悉：生产用动物细胞的种类，

2、动物细胞大规模培养的主要方法和操作方式。了解：动物细胞生物反应器的基本知识，动物细胞制药的发展前景。42022/8/3第一节 概述一、动物细胞培养的历史二、细胞工程学三、动物细胞制药发展历史2022/8/35动物细胞工程制药两大内容：在无菌和人工控制的条件下培养动物细胞以获得多肽和蛋白质药物；按照预定的设计，根据细胞生物学及工程学原理，采用遗传操作技术定向改造动物细胞及动物细胞的遗传性状，利用转基因动物或转基因动物细胞生产疫苗、多肽和蛋白质。已成为生物制药最重要的组成部分之一2022/8/36基因重组细胞组织培养或细胞培养：将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体体内的生理条件进行培养，使之生存

3、和生长。一、动物细胞培养的历史2022/8/37动物细胞体外培养历史上的里程碑1885年 德国Roux生理盐水培养鸡胚神经板组织，首次提出“tissue culture”1897年 Loeb从血液和结缔组织中分离细胞可在血清和血浆中存活 1903年 Jolly观察到蝾螈细胞在体外可进行分裂1907年 Harrison无菌条件下培养了离体的蛙胚神经组织，观察到神经细胞突起的生长过程；并在实验中整理出一套合理的无菌操作技术，被公认为组织培养之父1923年Carrel发明了卡式瓶培养法，将鸡胚的心肌组织持续培养了34年。2022/8/3820世纪50年代，各种培养操作技术、培养器皿和培养基孕育而生。

4、Earle首创单个细胞克隆培养方法，建立了可无限传代的C3H小鼠结缔组织细胞系。1951年，Gay建立了第一个上皮型细胞系人宫颈癌Hela细胞系。1957年，Dulbecco采用胰酶消化处理组织块，用液体培养的方法获得了单层细胞，开创了真正意义上的动物细胞培养技术。1962年，Capstick成功大规模悬浮培养小鼠肾细胞，标志着动物细胞大规模培养技术的起步。1975年，Kohler和Milstein成功融合小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞。动物细胞体外培养历史上的里程碑2022/8/39细胞工程：以细胞为单位，按照人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技

5、术使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或生产新品种的目的，使细胞增加或重新获得产生某些特定产物的能力，并提取出对人类有用的产品。 P79 二、细胞工程学2022/8/310细胞工程学（Cellular engineering）Cellular engineering includes tissue engineering and bioprocess engineering. Tissue engineering involves the use of living cells in the development of biological substitutes for the re

6、storation or replacement of function. Bioprocess engineering use of living cells to manufacture a biochemical product, e.g., through the use of recombinant DNA technology. As biomedical engineering has expanded to include the cellular level, and bioprocess engineering has shifted in interest from mi

7、crobial organisms to include mammalian cells, there are intellectual issues in which an interest is shared by these two formerly separate areas of engineering activity. 2022/8/311细胞工程学细胞工程(cellular engineering)包括生物医学工程（biomedical engineering）及生物工艺工程（bioprocess engineering）生物医学工程由组织工程（tissue engineer

8、ing）发展而来，指运用活细胞开发生物再生物或功能替代物，由器官和组织培养发展至细胞乃至亚细胞培养。生物工艺工程是运用活细胞制造生物医学产物，通常是运用重组DNA技术 。由微生物向哺乳动物细胞转移二者交叉于细胞培养技术，形成共性的知识产权由这两个领域分享。122022/8/3组织工程：利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。在体外进行细胞培养，让细胞增殖，从而再造器官。 2022/8/313Vacanti Mouse：人耳鼠2022/8/314三、动物细胞制药的发展历史1949年，Enders及其同事用哺乳动物原代细胞生产灭活脊髓灰质炎病毒疫苗，开创了先河。1

9、986年用淋巴母细胞Namalwa生产干扰素批准用于临床。此后，Vero细胞生产狂苗和脊髓灰质炎疫苗大量应用。1987年，杂交瘤细胞培养OKT3单抗批准用于临床。1988年之后一大批用转化细胞生产的重组基因产品陆续批准上市，标志着动物细胞制药新型产业的形成。如今，动物细胞工程制药在生物制药的研究和应用中起关键作用，投放市场及临床试验中的重组蛋白有70%来自哺乳动物细胞培养。2022/8/315细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。动物细胞用于生物制品生产可进行翻译后修饰、正确的切割折叠。蛋白正确折叠、二硫键形成、多聚化、蛋白酶加工、磷酸化、充分糖基化（内质网、高尔基体）广泛应用于生物制品生

10、产疫苗：乙肝疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰质炎疫苗、乙脑疫苗细胞因子：干扰素、EPO、凝血因子VIII等单克隆抗体及抗体类融合蛋白：OKT3、Herceptin、Avastin、Erbitux，Rituximab、Humira等2022/8/3162022/8/3FDA 批准的抗体药物全抗体 37个（至2014.10月）抗体片段 3个ADC 3个（1个已撤市）双特异抗体 2个Fc融合蛋白 7个鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg200

11、1Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010ActemraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014Cyramza SylvantEntyvioKeytruda第二节 动物细胞的体外培养一、体外培养细胞的类型二、动物细胞的化学组成和代谢三、动物细胞的培养特性2022/8/318离体培养细胞分类 贴壁细胞

12、悬浮细胞 兼性贴壁细胞2022/8/3191. 贴壁细胞（非淋巴组织细胞、异倍体细胞） 生长须有可贴附的支持物表面，依靠自身分泌或培养基中提供的贴附因子在表面上生长。 两种形态： 上皮细胞型细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肺泡上皮等皆呈上皮型形态。胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。2022/8/320成纤维细胞型 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如来源于淋巴的细胞。2. 悬浮细胞（血液、淋巴细胞、杂交瘤细胞）2022/8/3213. 兼性贴壁细胞（CHO、L9

13、29、BHK）兼具上述两种生长方式。中国仓鼠卵巢细胞CHO和小鼠肺纤维瘤L929细胞：当贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时呈圆形。2022/8/322二、动物细胞的化学组成和代谢1. 动物细胞的化学组成蛋白质、糖类、脂类、核酸、水、无机盐。2. 动物细胞的代谢糖酵解、三羧酸循环2022/8/323三、动物细胞的培养特性1. 细胞的分裂周期长2022/8/3242. 多数细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象接触抑制（contact inhibition）：细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。特点：保

14、持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加。 有：大多数细胞 无：少数悬浮培养细胞、癌细胞2022/8/325动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶1代细胞原代培养50代细胞传代培养无限传代？单个细胞加培养液3. 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的2022/8/3264. 动物细胞具有环境敏感性动物细胞与植物细胞和微生物细胞相比培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。动物细胞对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活（渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素）。2022/8/327必需氨基酸 维生素 无机盐和微量元素 葡萄

15、糖 细胞生长因子、贴壁因子等5. 动物细胞对培养基要求高2022/8/328 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 与粗面内质网结合的核糖体 游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白，多为糖蛋白（N-链寡糖、O-链寡糖）。 6. 动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。2022/8/3292022/8/3302022/8/3317. 胞外分泌，纯化方便；翻译后修饰（糖基化），与天然产品一致。2022/8/332动物细胞培养的环境条件动物细胞营养要求培养基和其他常用液体洁净及无菌适宜的培养环境充足营养第三节 动物细胞的培养条件和培养基2

16、022/8/333动物细胞培养的环境条件（一）防止污染洁净间器皿和器材水（二）培养条件pH渗透压培养温度空气基本营养物质2022/8/334（一） 防止污染 1.洁净室/ 无菌室：（1）定期打扫无菌室：清洁与消毒；（2）CO2培养箱、摇床灭菌（先用3新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射）。（3）实验前灭菌：打开紫外灯、空气净化器系统各20-30分钟（4）实验后灭菌：用75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。动物细胞培养的环境条件2022/8/3352.器材的清洗和消毒玻璃器械洗消，初次使用需酸泡金属器皿（不能泡酸）举例：布类、玻璃制品、金属器械

17、等物品：先121, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；培养液、平衡盐溶液液体：121, 15 磅, 20 分钟；玻璃瓶：干热灭菌170, 4 小时。2022/8/3362022/8/337自动双重纯水蒸馏器 纯水仪 注射水制水设备3.水清洗、配制培养液超纯水：电阻值大于18M，去内毒素。2022/8/338无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力，因此培养基应达到：无化学物质污染无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作对于合成

18、培养基，污染主要来源于配置过程，配制所用的水、器皿应十分洁净，配置后应严格过滤除菌。2022/8/339（二）培养条件1. pH动物细胞培养的最适pH为7.27.4，低于6.8或高于7.6会对细胞产生不利影响，严重时可引起细胞退变甚至死亡。培养基应具有一定的缓冲能力，必须加入缓冲系统： 如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4缓冲系统、 NaHCO3/CO2缓冲系统等2022/8/3402. 渗透压细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。最理想的渗透压为290300mOsm/kg为调整培养液的渗透压，一般采用加减NaCl的方法： 1mg/ml NaCl-32mOs

19、m/kg在细胞培养操作中，为保持合适的渗透压和pH，一般都使用平衡盐溶液（BBS），由无机盐和葡萄糖组成。2022/8/3413. 温度动物细胞最佳培养温度：370.5昆虫细胞最佳培养温度：27 温度过高：细胞退变甚至死亡温度过低：降低代谢和生长速度，影响产量2022/8/3424. 空气方瓶和转瓶培养时，保持瓶内有足够的空间，即培养的液体量不超过总体积的30%。采用生物反应器需通气，采用不同比例的O2、CO2和空气。2022/8/343二、动物细胞的营养要求特点：碳源不能为无机物，大多为葡萄糖氮源不能为无机物，主要为各种氨基酸，Gln多数情况下需添加520%的小牛血清或胎牛血清三、培养基及其

20、他溶液（一）动物细胞培养基天然培养基合成培养基无血清培养基（二）常用的其他溶液平衡盐溶液培养基pH调整溶液细胞消化液抗生素溶液2022/8/344 血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，组分不稳定，影响对产物的提取。易发生支原体污染（一）动物细胞培养基1. 天然培养基（制药工程不采用）2022/8/3452. 合成培养基 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成。 主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定；成本低。 缺点： 缺少某些成分，细胞不能增殖、贴壁

21、需添加动物血清（BCS/FBS）。已商业化的培养基：RPMI1640、MEM、DMEM、F12等。2022/8/346添加小牛血清的作用：（1）提供生长因子和激素（2）提供贴附因子和伸展因子（3）提供结合蛋白（4）提供必需脂肪酸和微量元素2022/8/347 不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的合成培养基，在合成培养基的基础上引入成分完全明确的或部分明确的血清替代成分。3. 无血清培养基（SFM）（1）生长因子和激素（2）结合蛋白（3）贴附因子和伸展因子（4）有利于细胞生长的因子和元素无血清培养基加入添加剂2022/8/348无血清培养基优点：第一代：20世纪5070年代，虽

22、不含血清，但含有大量动物或植物蛋白，如BSA或激素等；第二代：20世纪8090年代，完全不用动物来源蛋白质且蛋白含量很低,使重组蛋白纯化简单，目前市售主要为该类；第三代（PFM/CDM）：完全不含有蛋白，没有任何动物、人类蛋白或多肽，为表达产品下游提供极大方便。成分明确，来源可控，提高重复性。减少动物原性污染，如病毒、支原体等。便于目的终末产品纯化，减少干扰。避免血清对细胞的毒性，如抑制因子、毒性因子。目前无血清培养基已进入第三代2022/8/349例： RPMI-1640培养基的配制 培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 100单位/毫升加注射水/三蒸水至 1000ml，过滤除菌。

23、调节pH值至7.2。加血清（终浓度 10）。 动物细胞培养基的配制不能高压灭菌2022/8/350（二）动物细胞培养常用的其他溶液平衡盐溶液（BSS）：由生理盐水和葡萄糖组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸碱平衡功能。常用：Hanks、D-Hanks、Eeale。培养基pH调整液：大部分合成培养液都呈微酸性，培养前需将pH调整到所需的范围，3.7%、5.6%、7.4% NaHCO3、HEPES等。2022/8/3512022/8/3523.细胞消化液：组织块解离分散或传代培养时使细胞脱离贴壁器皿表面。1）胰蛋白酶溶液：浓度为0.125%，0.25%，消化结束时加入少量血清或含血清培养基终止酶

24、作用。2）EDTA溶液：浓度0.02%，使用完用Hanks液冲洗干净。4. 抗生素溶液：防止微生物污染，生物制药用动物细胞不添加，常用青霉素-链霉素，推荐青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。2022/8/353第四节 动物细胞培养基本方法一、细胞分离二、细胞计数三、细胞传代四、细胞冻存与复苏2022/8/3541. 离心分离从含有细胞的体液（血液、腹水、羊水等）中分离细胞2. 消化分离从生物体取组织，利用消化液使组织松散成细胞悬液，最终获得所需细胞消化液：1%胰蛋白酶、0.02%EDTA、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA等一、细胞分离2022/8/355二、细胞

25、计数自动细胞计数器计数血球计数板计数结晶紫染色细胞核计数法MTT染色计数法(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝)2022/8/356定义：将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作。意义：为维持细胞生长和获得更多的细胞量需进行细胞的传代培养。避免因密度过大、生存空间不足、代谢产物浓度过高等造成细胞衰老、死亡。悬浮生长细胞传代贴壁细胞传代三、细胞传代2022/8/357贴壁细胞传代的注意事项消化前

26、确定细胞有无污染加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可消化时间不宜过长，室温静置2-5min要终止消化，加入有血清的培养基分种/瓶/皿数量取决于细胞数和细胞特性，多数以20-30万个/ml，每次1传2或1传3为宜；已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次二倍体细胞每次传代时应写上传代次数传代后每天或隔一天换液，3-5d传代一次2022/8/358四、细胞的冻存和复苏1. 细胞的冻存 在-70以下细胞内酶活性均已停止，代谢处于完全停止状态，可以长期保存。目前都采用-196液氮保存。冻存过程需加入保护剂，二甲亚砜（DMSO）、甘油。逐渐降温，保持一定降温速度，以1/min的速度下降为宜（

27、慢冻）。注意事项：冻存细胞应处于对数生长期且存活率较高；细胞应处于良好的营养状态，冻存前一天换液培养；细胞密度以1-2106个/ml为宜；冻存用培养基应与实际使用的一致，DMSO过滤除菌；冻存管要密封好标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。2022/8/3592.细胞的复苏（总的要求是快融）注意事项：从液氮中取出后，立即丢入37-40温水的搪瓷杯中，并快速搅动加速融化（1min内）；用乙醇消毒冻存管外表；尽早除去二甲亚砜（ 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上），离心，换新鲜培养液；隔天观察细胞生长情况，再换液一次。2022/8/3602022/8/361第五节 生产用动物细胞的要求和获得一

28、、生产用动物细胞的要求二、生产用动物细胞的获得三、基因工程细胞的构建和筛选四、常用生产用动物细胞的特性五、细胞库的建立 2022/8/36263来源和历史明确建立和培养历史清楚细胞一般特性应提供宿主细胞来源的相关资料和证明性文件说明是否进行过遗传操作引入外源基因序列描述已进行过的研究检定项目例如：细胞检定、内源和外源因子检测等的结果。培养历史要有详细的记录和说明，用于建档和备查。传代过程中所用的人源或动物源性材料，应有说明性材料。一、生产用动物细胞的要求1.需阐述宿主细胞的基本特征,如形态、培养和生长一般特性、培养条件和培养液要求。2.尽可能提供宿主细胞的特征如鉴别标志，种属鉴定如：鼠源、人源

29、和其他动物来源的确证资料。从评价的角度主要关注追溯性，溯源性CFDA重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价的一般原则2022/8/363二、生产用动物细胞的获得早期：1. 原代细胞 直接取自动物组织器官，经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。 特点：刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态；需要大量动物，费钱费劳力。 常用：鸡胚细胞、兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。2022/8/3642. 传代细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞系。 特点：细胞分裂增殖旺盛，二倍体核型；有接触抑制和贴壁依赖性；增殖能力

30、有限，无致瘤性。 常用：人胚肺成纤维细胞（WI-38、MRC-5、2BS）2022/8/3653. 转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的、人工的或从肿瘤组织中建立的。 特点：长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低，适于大规模工业化生产。2022/8/366细胞悬液1代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞系细胞株注意界定原代培养和传代培养、细胞株和细胞系!遗传物质改变2022/8/3674. 融合细胞系细胞融合(cell fusion) 2022/8/368融合方法病毒诱导融合：最常用的是灭

31、活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。化学融合剂诱导融合：高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。电融合：细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。2022/8/3695. 重组工程细胞系采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。2022/8/370（一） 真核细胞基因表达载体的构建使用的载体有两类：1. 病毒载体 牛痘病毒用构建多价疫苗 腺病毒用于基因治疗 逆转录病毒用于基因治疗 杆状病毒用于外源基因表达三、基因工程

32、细胞的构建和筛选（略）2022/8/371 杆状病毒作为载体的优点：双链DNA，易重组插入78kb DNA不影响正常病毒粒子的形成。多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%30%；2022/8/372用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。 如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。光镜照片扫描电镜照片2022/8/3732. 质粒载体穿梭质粒载体：在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。基本成分： 允许载体在细胞内扩增的质粒序列。 含有使基因表达的调控元件。

33、用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。2022/8/374（二） 基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选2022/8/375基因载体导入动物细胞的常用方法： 磷酸钙沉淀法：溶解的DNA加在Na2HPO4溶液内，和CaCl2形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。 电穿孔法：借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。2022/8/376四、常用生产用动物细胞的特性2022/8/377CHO-K1（CHO-DG44

34、、CHO-S）实验中常用的一个细胞株，在生物制药中使用也非常广泛。来源：Cricetulus griseus (中国仓鼠) 卵巢 形态：上皮细胞生长特性：兼性（悬浮、贴别）培养基：DEME培养基，0.1mmol/L次黄嘌呤，0.1mmol/L胸苷，10%小牛血清，加入脯氨酸。冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。2022/8/378Vero： 1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。 是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率为1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。2022/8

35、/379 BHK-21来源：地鼠幼鼠肾脏形态：成纤维样细胞生长特性：贴壁核型：2n=44培养基：DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。2022/8/380Namalwa： 1972年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞。 该细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有1214条标记染色体，单条X染色体，无Y染色体。通常用的培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大规模生产-干扰素。2022/8/381五、细胞库的建立生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：1. 原始细胞库/主细胞库

36、（PBC，master cell bank，MBC）2. 生产用细胞库（manufacturers working cell bank，MWCB）或工作细胞库（working cell bank，WCB）细胞库要求：稳定，均一和同质，充分全面的检定，保存的数目及传代水平保证生产用细胞的持续稳定供应。2022/8/382种子库的建立、检定、保存及传代稳定性资料 （ICH Q5B,Q5D 中国药典（三部）“通则”）建立两级细胞（种子）库，要求来源、详细的传代历史、制备方法，包括建库过程的培养方法、试剂、代次、贮存条件。保证连续生产的建库策略（方案），包括生产时细胞库的使用率、新工作种子库的建立频次

37、（周期）、种子库的质量标准。 以确保均一、可追溯主细胞（种子）库（Master Cell Bank） 从最初克隆或源于最初克隆的初级细胞库获得贮存时须有该细胞的详细档案，包括：该细胞系的历史该细胞系的特性对各种有害因子的检查结果工作细胞（种子）库 来源于一支或多支 MCB，新制备的 WCB 应检定并符合生产要求。2022/8/383 种子库的检定及稳定性（Derivation and Characterisation of Cell Substrates） 目的：证实用于生产的种子特征、生物纯度以保证可用性（质量） 鉴别：有限的种属鉴别：选择性培养基，辅以噬菌体分型法（phage typing

38、）表达质粒相关鉴别：DNA水平及产物水平 纯度：无外源性微生物因子及细胞污染，如细菌、真菌、支原体、病毒因子等。 稳定性：产物表达的一致性（consistent）及在规定贮存条件下产能的维持。至少两个时间点的测试：最少传代培养细胞及生产申请时使用达到细胞体外传代限度或超过该限度的细胞，以确定传代的次数。2022/8/384两级细胞库及细胞库大小的确立依据2022/8/385第六节 动物细胞大量培养的方法悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养（1）微载体培养（2）多孔载体培养（3）微囊化培养2022/8/3861. 悬浮培养（suspension culture）：细胞悬浮于培养基内生长繁殖。适用于非贴

39、壁依赖性细胞和兼性细胞。优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和 传氧较好，容易扩大培养规模，经验丰富目前生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌式生物反应器。2022/8/387细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于贴附依赖性细胞和兼性细胞。2. 贴壁培养（anchorage-dependent culture）2022/8/388优点：适用细胞种类广，易采用灌流培养使细胞达到高密度缺点：操作比较麻烦，需要贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差；传代时需要用酶消化。目前生产中用于贴壁培养的设备主要是转床反应器。2022/8/3893. 贴壁-悬浮培养（1）微载体培养（2

40、）多孔载体培养（3）微囊化培养（4）中空纤维培养法2022/8/390（1）微载体培养（microcarrier culture） 使依赖贴壁的细胞在悬浮培养时贴附在颗粒表面单层生长，增加细胞贴附生长的面积。在载体上培养的细胞产生抗原、干扰素、疫苗等的能力与常规单层贴壁培养细胞相当。2022/8/391优点：兼有悬浮培养和固定化培养的优点，适用于正常细胞核二倍体传代细胞。创造大的贴附面积、携带细胞自由地悬浮在培养基内。MCC细胞在Cytodex-3微载体表面贴附生长情况 理想的微载体应具备P59： 生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当；粒径均一，在60250m之间；光学透明；载体基质柔软；耐

41、高压、高温；反复多次使用；制备简单，原料充分。2022/8/392（2）多孔微载体近年发展起来大规模、高密度动物细胞培养方法。内部多孔，提供细胞生长，避免受搅拌等造成机械损伤；搅拌速度和通气量可提高，细胞营养、氧气传质速度增加；2022/8/393（3）包埋和微囊培养借鉴了酶固定化技术，模拟人工细胞，将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。优点：细胞获得保护，减少剪切力损伤；较高细胞密度终产品浓度和纯度都得以提高。2022/8/394（4）中空纤维反应器由外壳和数以千计的醋酸纤维制成的中空纤维(内径200m -500m，外径300m -900m)组成。内层紧密、光滑，具有一定分子量截流值。 外层为

42、多孔的海绵状支持层，细胞被固定在支持层中 。反应器的形状为管式或列管式，中空纤维可承受较大压力，通过正常超滤程序将底物压入内壁与海绵状介质上的酶起反应。 一、动物细胞生物反应器的类型及基本结构二、动物细胞生物反应器的检测控制系统三、动物细胞生物反应器的主要操作模式962022/8/3第七节 动物细胞生物反应器第七节 动物细胞生物反应器理想的动物生物反应器的基本要求：各种材料对细胞必须无毒性；良好的传质、传热和混合性能；密封性能良好，可避免外来微生物的污染；对物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一；可长期连续运转；容器加工制造时要求内面光滑，无死角；拆装、连接和清洁

43、方便，耐高压蒸汽消毒便于操作维修；设备成本尽可能低。2022/8/3971. 搅拌式生物反应器2. 气升式生物反应器3. 中空纤维式生物反应器4. 透析袋或膜式生物反应器5. 固定床或流化床式生物反应器6.一次性生物反应器一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构2022/8/3981. 搅拌式生物反应器通用式发酵罐2022/8/399（1）罐体的高径比一般采用11.5:1；培养动物的罐底为圆形，以避免细胞和载体沉积在周边；（2）搅拌速度慢，一般在20100r/min，多数采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器；（3）一般采用无气泡通气系统，以解决由于气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤；

44、改造：2022/8/3100笼式通气搅拌生物反应器： 通气/调 pH 都在笼内进行，产生的气泡由 400 目的不锈钢丝网阻断，不会因气泡破裂产生剪切力直接损伤细胞，气孔由多孔分布器发散，以满足细胞对溶氧的需求。2022/8/31012. 气升式生物反应器特点：与搅拌式生物反应器相比，剪切力小，反应器径高比一般为10 :1，气泡直径12mm，空气流速 0.010.06 vvm；主要用于微载体培养。2022/8/31023. 中空纤维式生物反应器纤维材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50100m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200 m。由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，可以垂直也可为

45、平行床式，主要用于贴壁细胞培养2022/8/3103将反应器内设置成二室或三室系统，根据需要室间装有滤膜。可将有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。4. 透析袋或膜式生物反应器2022/8/31042022/8/31055. 固定床或流化床式生物反应器装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。多适合微载体、灌流培养。2022/8/3106Celligen plus生物反应器NBS公司在原来的笼式通气搅拌式基础上，开发Celligen plus生物反应器，其是将通气搅拌与

46、固定床巧妙结合的一种新型生物反应器2022/8/31076. 一次性生物反应器1082022/8/3一次性生物反应器特点袋子一次性使用，可消除污染及交叉污染。降低大量清洗成本减少GMP的验证工作。1092022/8/3 一次性摇袋式细胞培养生物反应器（Wave）：研发始于1996年，1998年投入商品化生产，适用于各种类型细胞培养：CHO，NS0，BHK, HEK293，T细胞、杂交瘤等。培养基液体在袋中形成波浪式运动，良好的混合作用，剪切力小；一次性摇动细胞生物反应器1102022/8/3由实验室摇床培养模式线性放大，适合各种动物细胞及植物细胞培养；更低剪切力、更高传质效率；目前市售最大20

47、0L，正在开发2500L规模。微型一次性搅拌细胞生物反应器1112022/8/3+搅拌式微型生物反应器，由大规模搅拌式生物反应器线性缩小，工作体积1015ml；适合悬浮细胞培养；便于多参数优化及线性放大；可同时进行48个独立反应器工作。二、动物细胞生物反应器的检测控制系统1. 培养过程需检测的物化参数 直接在线检出：温度、pH、搅拌速度、溶氧 取样离线检测：活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖、乳酸和铵离子的检测 检测后计算：细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生物反应器生产率2022/8/31122. 主要参数的检测和控制方法（1）温度（2）pH在培养初期，控制进CO2量

48、 当细胞密度提高后控制NaHCO3的量 （3）溶氧 （4）搅拌 （5）进出液流量 （6）其它 动物细胞对搅拌引起的剪切力和气泡很敏感，要保持所需的溶氧很困难，常采用的措施有：改变进气的组成：不同比例的O2、N2、CO2和空气加大通气流量适当提高转速在反应器外通气适当提高罐压2022/8/3113三、动物细胞培养的操作方式分批式培养（batch）/补料-分批式（fed-batch）半连续式培养（semi-continuous）灌流式培养（perfusion）2022/8/31141.分批式/流加-分批式分批式（Batch）：较早期采用的方式，也是其他操作方式的基础。将细胞扩大培养后一次性加入反应

49、器内进行培养，培养过程体积不变，不添加其他成分，而只向培养基中通入氧，能够控制pH、温度、通气量。一次性收获细胞、产物、培养基。流加-分批式（Fed-batch）：在batch培养基础上，细胞初始接种培养基体积一般为1/22/3，过程中流加浓缩营养成分，保持浓度不变，结束后将反应物取出。2022/8/31152.半连续式操作定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。2022/8/31163.灌流式操作（Perfusion，continuous）定义：当细胞和培养基一

50、起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。与半连续式操作不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而半连续式培养则同时也取出了部分细胞。优点：细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，有害代谢废物浓度低；可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；2022/8/31171182022/8/31192022/8/3一、动物细胞产品常用的纯化方法二、动物细胞产品的质量要求第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求（略）2022/8/3120下游纯化成分复杂：工程细胞表达的产品，常和宿主蛋白、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，分离难度大。人用药物纯度要求高：为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度