传染病方法学检测在临床应用中的局限性课件

1、传染病方法学检测在临床应用中的局限性第1页，共30页。传染病检测的方法学1.固相膜免疫测定(常用胶体金快速检测法)2.酶联免疫吸附实验3.化学发光免疫分析(CLEIA)4.放射免疫技术5.免疫放射技术第2页，共30页。一、胶体金检测原理原理:是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并置于吸水材料上。基于层析横流，分为四部分 吸水纸；玻璃纤维膜，膜上固定着干燥的金标抗体硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状的抗体；吸水纸。第3页，共30页。第4页，共30页。胶体金测试操作方法1.处理标本（将标本离心取血清或血浆）2.滴加适量的血清或血浆3.规定时间（一般10-20分钟）内

2、上报结果第5页，共30页。优点1.简便，快速2.单份测定,保存期长（优质试剂）3.可测定物范围广（主要为定性实验）4.感染性疾病的诊断、妊娠、排卵的诊断，6肿瘤、心肌的标志第6页，共30页。局限性1.敏感度略低，价格略高（与ELISA）2.精密度较差，质控困难（胶体金无法做质控也就无法保证每个试剂条的准确性。）3.稳定性较差4.不易制备定量、半定量试剂第7页，共30页。出现假阴性情况可出现假阴性（灵敏度低）1.有最低值检测线（低于最低检测值浓度的抗原或抗体无法检测到）2.高浓度的抗原易出现钩状效应。 钩状效应：当抗原过量时形成的IC（抗原抗体合物）分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，易产

3、生假阴性.第8页，共30页。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均 相非均相固相酶免疫测定（常用酶联免疫吸附实验）液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或抗体的定性和定量第9页，共30页。均相酶免疫法 利用酶标志物与相应抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结合和游离酶标志物分离情况下，通过测定标记酶的活性的改变，确定抗原或抗体的含量。（了解）第10页，共30页。二、酶免吸附试验（ELISA）原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析第11页，共30页。1、已知抗体包 被于载体表面3、加酶标抗

4、体 与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物 不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包 被于载体表面2、加待检物无抗 原与抗体结合3、加酶标抗体 无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY第12页，共30页。以HbsAg为例讲述酶免操作步骤1.取一定量HbsAg包被孔，编号。留一空作空白对照，加入样本稀释液20ul每孔，其余加入阴性对照三孔和阳性对照两孔及待测标本100ul每孔于相应孔中。（此方法法阴、阳性对照能够很好的反应当天试剂的稳定情况）第13页，共30页。2.微型震荡仪震荡

5、30s使孔中液体充分混合，置37C温育60min。3.各孔加入酶结合物50ul，震荡、置37C温育30min4.洗板、拍干10min5.每孔加入底物液、显色剂各50ul，37避光温育30min 6.加终止液50ul，震荡、酶标仪测试出结果第14页，共30页。7.检验人员核实结果，对照信息后签字、核发。第15页，共30页。酶联吸附实验的优点灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。第16页，共30页。酶联吸附试验的局限性操作麻烦适合大批量操作，手工肉眼比色时容易有偏差，产生假阴性。对试剂的特异性，灵敏度要求高， 实验中的

6、假阳性、假阴性结果是完 不可能避免的。第17页，共30页。案例经过女性，40岁，孕17周。既往怀孕3次，育有2子，来院门诊第一次产检，孕妇主诉否认既往传染病史及输血史、手术史。使用酶法测定乙肝五项结果1，3，5阳性（俗称大三阳），本实验室有个习惯：HBsAg阳性标本都会用胶体金乙肝表面抗原验证来确定结果，然而胶体金HBsAg阴性第18页，共30页。案列分析胶体金试剂筛查乙型肝炎（HBV）血清学标志物，结果为- - + - +孕妇就诊期间生化结果:ALT123U/LAST105U/LTB39umol/L肝脏B超无明显异常。第19页，共30页。案例分析将血清进行10倍和100倍稀释后复测HBsAg

7、，结果阳性。此案例说明，胶体金检测乙肝表面抗原时存在了钩状效应. 假如此案例中血清稀释后胶体金检测仍然为阴性，检验人员下一步怎么办？ 进行病人血清中HBV病毒量检测第20页，共30页。案件总结1.本案列的HBV结果酶免检测结果属于典型传统意义的乙肝大三阳，胶体金试验作为一种即刻试验具有简便快速不依赖机器等优点，备受临床医生青睐2.胶体金检测灵敏度不及酶免和发光，可能会漏检，一些HBsAg低值或高值阳性标本。在本案例中是高值，临床中不常见到。第21页，共30页。案列总结3.在真正意义的急查下，胶体金试验结果只作为初筛试验仅作参考。（以酶免实验结果为准）4.建议临床医生（特别是手术室的医务人员）要

8、高度重视自己的防护意识。因为目前技术水平的原因，传染性疾病在窗口期也无法检测到。第22页，共30页。 化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。三、化学发化学光第23页，共30页。化学发光免疫分型 1.直接化学发光免疫 2.化学发光酶免疫分析（本院使用） 3.电化学发光免疫分析第24页，共30页。化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（CLEIA）:是用参与催化某一化学反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗体或抗原与待测标本中相应的抗原或抗体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催第25页，共30页。 化和分解底物发光。由光量子阅读系统接受，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，经计算机数据处理，计算出测定物浓度。第26页，共30页。辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 第27页，共30页。化学发光免疫的优点1