临床免疫学与检验：第二十二章 金免疫技术

1、第二十二章 金免疫技术colloidal gold immunoassay technique金免疫技术（colloidal gold immunoassay technique）是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术。1970s由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。金免疫技术用于: 免疫组织化学染色; 金免疫测定第一节 胶体金与免疫金的制备一、胶体金特性及其制备二、免疫金的制备三、免疫金的保存一、胶体金特性及其制备1.胶体金的结构 2.胶体金性状3.胶体金的制备 4.胶体金鉴定 5.胶体金保存 6.注意事项 1.胶体金的结构胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（g

2、old solution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。2.胶体金性状（1）胶体金一般性质： 胶体金颗粒大小多在1100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质

3、的敏感性。（2）胶体金的颜色和光吸收性：对同一种物质的水溶胶金颗粒来说，粒子大小不同，颜色亦不同：胶体金颗粒在520nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色。胶体金颗粒2040nm之间吸收波长530nm，液体为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。3.胶体金的制备（1）制备原理 向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等。（2）操作要点 最常用的制

4、备方法为柠檬酸盐还原法。 表22-1 四种粒径胶体金的制备及特性胶体金粒径（nm）1柠檬酸三钠加入量（ml）*胶体金特性呈色max16.002.00橙色518nm24.501.50橙红522nm41.001.00红色525nm71.500.70紫色535nm4.胶体金鉴定制好高质量的胶体金却也并非易事。可用分光光度计扫描max来估计金颗粒的粒径。制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。5.胶体金保存胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存

5、，加入少许防腐剂（如0.02NaN3）可有利于保存。6.注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。（4）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。二、免疫金的制备免疫金（immunogold）是指胶体金与抗原（抗体）的结合物,在免疫组织化学技术中，习惯上要称之为金探针。1.制备原理胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋

6、白质的正电荷基团间靠静电力相互吸引，达到范德华引力范围内即形成牢固的结合,同时胶体金颗粒的粗糙表面也是形成吸附的重要条件。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附2.技术要点（1）胶体金溶液的pH值调整 用K2CO3或 HCl溶液调节胶体金溶液的pH至选定 值。（2）蛋白质最适标记量的确定（3）标记过程 在电磁搅拌下将1/10体积的合适浓 度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应一定 时间后加入 BSA并调整pH至8.5，放置室温继 续反应数分钟。（4）离心分离 三、免疫金的保存免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。

7、稀释液通常是加入含稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。第二节 金免疫测定一、斑点金免疫渗滤试验二、 斑点金免疫层析试验一、斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)原理: 斑点金免疫渗滤试验是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上（这种固相载体具有过滤性能）制成抗原或抗体包被的微孔滤膜贴置于吸水材料上，依次滴加在膜上的标本、免疫金、及洗涤液等液体很快渗入吸水材料中，最后阳性反应在膜上

8、呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的。 方法类型1双抗体夹心法 2间接法技术要点图20-1 DIGFA渗滤装置及操作示意图 二、 斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay,DICA） (一) 原理：斑点金免疫层析试验中滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果。(二) 方法类型 1.双抗体夹心法2.

9、竞争法 3.间接法 1.双抗体夹心法图22-2 免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原 2.竞争法 图22-3 免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图 3间接法为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法(图22-4)。测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡，A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异

10、性IgG及无关物向E处反向层析，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。三. 临床应用及评价1.免疫金技术具有操作简便、快捷以及操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定，便于保存等特点，因此特别符合“床边检验” (point of care test,POCT)项目要求。2.本法灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，在临床应用中应引起高度重视。3.该技术不能准确定量，只能作为定性或半定量试验，目前主要应用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）的检

11、测。第三节 金免疫组织化学染色技术一、免疫金（银）光镜染色技术二、免疫金电镜染色技术一、免疫金（银）光镜染色技术（immunogold silver staining，IGSS）免疫金银染色是在金免疫技术基础上发展起来的更为敏感的技术。1983年，Holgate等人将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法。 (一)原理 免疫金银染色技术是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子(Ag+)还原成银原子(Ag)。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“，最终使抗原位置得

12、到清楚放大 。图22-5 免疫金银染色原理示意图 （二） 技术要点1. 配制银染色液 在pH3.5柠檬酸缓冲液中加入明胶、对苯二酚、硝酸银配制而成。2染色被检血清经适当稀释后均匀滴加在细胞抗原片上，被检血清中抗体与片上抗原结合，流水冲洗后再用缓冲液冲洗，加BSA进行封闭；滴加适当稀释的SPA-胶体金进行反应；滴加新鲜配制的银染液，室温避光染色反应；流水冲洗、晾干、中性树胶封片后光镜下检查，银灰色颗粒沉积者为阳性。（三）注意事项1此法具有分辨力高，定位精确的优点。2所带玻璃器皿应洁净，所用蒸馏水必须双蒸或三蒸。3配制胶体金溶液时，调整各试剂的比例可获直径不同的金颗粒。直径l0nm的金粒子不易穿透

13、组织，故作细胞内抗原定位时，以配制直径5nm的金溶胶为宜。4硝酸银、对苯二酚溶液应避光保存并临用时现配。5被检血清中有其他自身抗体，如抗平滑肌抗体，抗心肌抗体、抗线粒体抗体等其抗原片应根据专门试验的要求制备。 二、免疫金电镜染色技术（一） 原理 胶体金标记物与镍网上待检标本上相应蛋白质发生结合反应,由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故金标蛋白结合处，电镜下可见黑褐色颗粒，而从对细胞膜或细胞内的蛋白质进行定性与定位。（二） 技术要点1标本包理 戊二醛对标本进行固定，锇酸后固定(固定膜结构)，丙酮或乙醇逐级脱水，包埋(Epon812树脂)，超薄切片(80nm)置300目镍网上。2免疫组化染色 白

14、蛋白封闭，加第一抗体，孵育，PBS冲洗，卵白蛋白封闭，加第二抗体(胶体金标记IgG )，孵育，PBS冲洗，蒸馏水冲洗，醋酸双氧铀、枸橼酸铅复染，电镜观察。（三）注意事项1以上染色步骤除清洗外，皆在滴于蜡膜（封口膜）上的各种液体小滴上进行。应注意始终保持镍网湿润，不得任何一种液体干于网上，并要吸去镊子尖部夹起的多余液体。2用于电镜的免疫金法可分为包埋前染色和包埋后染色两大类，包埋后染色具有简便可靠，结果重复性好，能在同一组织切片上进行多重免疫染色的优点。但本法会使某些抗原失活，细胞膜结构不易保持完整。三、临床应用与评价1、胶体金在电镜水平主要应用于：细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。单层培养中细胞内抗原的检测。组织抗原的检测。该法样本用量少、检测速度快、对比明显、