实验一、细胞转染与传代课件

1、细胞转染和传代 实验目的：理解细胞转染的原理,掌握细胞转染的操作步骤。学习操净台内操作及注意事项掌握贴壁细胞传代方法和细胞计数板的使用学习荧光显微镜的结构、操作及注意事项。关于转染（transfection）细胞转染是指将外源的DNA，RNA等导入真核细胞的技术，是实验室工作中经常涉及的基本方法。外源核酸在细胞中的定位物理介导：电穿孔法、显微注射化学介导：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法生物介导：病毒介导法常用的转染方法细胞转染的类型瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到细胞的染色体中，因此一个细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天（24-72小时）。稳定转染：外源DNA可以整

2、合到细胞的染色体中，通常需要经过反复筛选才能得到稳定转染的同源细胞系。脂质体转染细胞的原理脂质体转染细胞的优点：操作方便，安全性高。转染对细胞的要求：细胞生长状态决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜；转染当日，在转染前4小时换新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换新鲜培养液。转染对DNA的要求： 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。报告基因编码的蛋白质非常容易被鉴定，因此常被用来检测目的基因表达的情况。 常用的报告基因系统: 半乳糖苷酶报告

3、系统 荧光素酶报告系统 荧光蛋白报告系统关于荧光蛋白Aequorea victoria水母GFP在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报告基因(reporter gene)。利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能 。可用于特定蛋白、各种细胞结构的标记定位。 GFP还常被用作荧光探针。利用信号转导中信号分子的迁移功能，将荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并

4、推断该分子在迁移中的功能。 绿色荧光蛋白的应用subcellular localization带标签的重组蛋白Recombinant proteinRFP-tagGFP-tagco-localizationProtein1.Protein2.mRFP-H2BGFP-B23GFP-SENP3RFP-B23关于GFP载体pEGFP-N1载体具有以下几方面特点： 该质粒具有很强的复制能力，可以随宿主细胞分裂时跟随细胞质成分遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一。 含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达。 具有多克隆位点，便于目的基因的插入。

5、该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。 这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达 实验材料HO8910：人卵巢癌细胞系转染质粒：pEGFP-N1载体，带有荧光蛋白基因的空质粒。脂质体：HilyMax阳离子脂质体，可应用于转染贴壁或悬浮细胞的瞬转及稳转，适用于含血清的培养基，细胞毒性低，效率高且稳定，也能用于转染siRNA。转染培养液：Opti-MEM，营养条件较好的无血清培养液，在含血清培养液中生长的大多数细胞都能转移到 Opti-MEM中。 转染实验时间安排第1次操作-形成DNA-脂质体复合物: 1g DNA(3l)加入 120l的OMEM中，轻弹

6、混匀，再加入3lHilyMax脂质体，轻弹混匀，室温放置15-25分钟。第2次操作-复合物加入到细胞培养皿中：吸取全部复合物，缓慢均匀滴加入培养皿，轻缓混匀。培养箱培养，第二天中午用荧光显微镜观察转染效果。转染实验操作注意事项1.进入细胞培养室前带上口罩2.操作前用75%酒精消毒双手3.操作在超净台内进行4.根据需要选择合适的移液枪5.做好标记超净台移液枪移液枪枪头传代 (passage,subculture)：当细胞在培养容器中增殖到一定密度，生存空间及营养物质缺乏，需按一定比例分离，接种至新的培养容器并更新培养液，这个过程称为细胞传代。一代: 细胞接种后到下一次传代的一段时间；可增殖几次。

7、培养细胞一代的三个阶段：潜伏期、指数增生期、平台期 实验研究多在指数增长期进行细胞的传代培养 一定密度“汇片”接种 平台期:有活力，无增殖贴壁铺展体积变大、数目增多 潜伏期：有活力，无增殖传代 指数增长期: 快速增殖， 增殖几次细胞数量培养细胞一代的增殖过程传代培养的实验原理:传代培养是组织培养常规保种方法之一,也是几乎所有细胞生物学实验的基础。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。(本次实验因条件限制，只能在一个模拟的环境下进行实验) 贴壁细胞消化后的应用：1. 继续传代培养2.计数、计算细胞活力，了解细胞的生长状况。3.制备细胞悬液，以备后期的继续实验。（重新铺板，

8、MTT实验；标记、流式分析、分选；爬片、免疫荧光；电转；提取和分离；洗涤、动物注射等）。肿瘤细胞株的传代/Portals/1/Pdf/tb07.pdf悬浮细胞的传代：离心或更新培养液贴壁细胞的传代：消化法（0.25%胰酶+0.66mM EDTA)应用计数板或活力检测仪3.细胞计数（Counting)细胞活力检测 （0.4% trypan blue 拒染）细胞的传代和计数的实验步骤1倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。 2吸去培养皿中原有的细胞培养液3培养皿中加入1-2 mL高压灭菌过的PBS，以洗去培养液的残留（培养液中的血清会抑制胰酶的消化作用）。洗涤可进行12次。4吸去PBS，

9、加入400l 0.1250.25的胰蛋白酶，盖上盖子，轻轻摇晃，使胰酶能均匀地作用于所有皿底的细胞。室温或37C放置12分钟，倒置显微镜下观察，当观察到细胞收回突起变圆时立即加入800l的含血清的新鲜培养基（可37预热），终止胰酶的作用，经反复吹打，制成细胞悬液。5细胞悬液制成后，即可进行传代。传代可按照1传2或者1传3等比例进行，也可在完成计数后，按一定的细胞量进行传代。细胞计数时，如果悬液的细胞密度过大，需先按一定比例稀释后，再进行计数。通过细胞计数还可计算出细胞的活力。以稀释10倍为例，取10l细胞悬液，加入到装有40l PBS的Ependorf管中，再加入50l 0.4% 台盼蓝溶液，

10、混匀后吸出10l加到计数板上进行一次计数，最终的细胞数要乘以10。另外，悬液也可收集到管中，离心后用PBS洗涤。完成3次细胞计数，计算细胞总数、活细胞数、细胞活力。将2.5104个活细胞传35mm的培养皿。细胞计数 细胞记数细胞数/ml原液=（4大格细胞数之和/4）104 台盼蓝0.4%染色法计数活细胞实验结果和记录一、每个实验组实验结果记录表格实验组（2.1）计数123细胞总数活细胞数细胞活力平均活力二、绘制细胞存活曲线（略）倒置荧光显微镜荧光显微镜的原理、构造 荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的

11、荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。 由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时，荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。它是由超高压光源、滤片系统、光学系统和摄影系统等主要部件组成。 12345101146（1）投射电源开关（2）聚光器（3）载物台（4）物镜（5）调焦操纵轮（6）透射光档片（10）载物台操纵轮（11） CCD光路 活动杆徕卡DMI300

12、0B倒置荧光显微镜（9）荧光转盘（7）荧光独立电源（8）荧光光栅拉杆（2）聚光器（3）载物台（4）物镜（5）调焦操纵轮2345789徕卡DMI3000B倒置荧光显微镜明 场：1打开右下方显微镜透射光电源（1）。 2设置聚光器（2），若只需要普通的明场观察，将聚光器设置为“BF”。 若需进行相差观察，按所选择的物镜放大倍数将聚光器设置为“PH1” (10、20)或“PH2” (40)。3将所需观察的标本置于载物台上（3）。4选择你要用的物镜（4） (4、10、20、40)。5利用调焦操纵轮（5）聚焦和观察图像。6若尚需采集图像，见操作步骤13“图像采集操作”。徕卡DMI3000B倒置显微镜操作步

13、骤 荧 光：7在明场观察之后，若还需进行荧光观察，可关闭显微镜透射光电源或上拨上方“Stop”档片（6），挡住透射光，并同时打开荧光独立电源（7） 。8打开左侧荧光光栅拉杆（8），使荧光光路打开。9转动荧光转盘（9），选择合适的荧光激发滤块(1、2: 空白 3:A蓝色 4:I3绿色 5:N2.1红色)。10选择你要用的物镜(4、10、20、40)。11利用调焦操纵轮，聚焦和观察图像。12若尚需采集图像，见操作“图像采集操作”。徕卡DMI3000B倒置显微镜操作步骤 转染实验结果观察20X倒置显微镜透射光图像20X倒置显微镜荧光图像注意事项: 本台电脑专用于显微镜图像采集，禁止使用未格式化的优盘拷贝文件