三重四极杆质谱法

1、DB37山东省地方标准DB37/T-2018水质磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定液相色谱-三重四极杆质谱法Waterquality-DeterminationofantibioticsofSulfonamides,QuinolonesandMacrolidesinwater-Liquidchromatographytriplequadrupolemassspectrometry（征求意见稿）201-口-发布201-口实施山东省质量技术监督局发布 目次TOC o 1-5 h z前言II适用范围1规范性引用文件1方法原理1干扰与消除1试剂和材料2仪器和设备3样品4分析步骤4结果计算与表示6

2、精密度和准确度7质量保证和质量控制8废物处理9附录A（规范性附录）方法的检出限和测定下限10附录B（资料性附录）液相色谱参考条件11附录C（资料性附录）质谱参考条件12附录D（资料性附录）标准物质、替代物及内标物质MRM谱图13附录E（资料性附录）方法的精密度和准确度17-LX.1冃IJ言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准附录A为规范性附录，附录B、附录C、附录D、附录E为资料性附录。本标准由山东省环保标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省环境监测中心站。本标准验证单位：济南市环境监测中心站、泰安市环境保护监测站、山东省分析测试中心、山东省产品质量检验研究院、青岛谱

3、尼测试有限公司、青岛市华测检测技术有限公司。本标准主要起草人：郭文建、张慧、朱晨、王桂勋、岳太星、李红莉、丁波涛。本标准为首次发布。本标准由山东省环境保护厅提出并负责解释。水质磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定液相色谱-三重四极杆质谱法警告：实验中使用的溶剂和试剂均具有一定的毒性，对健康具有潜在的危害，应尽量避免与这些化学品的直接接触。样品制备过程应在通风橱中进行，操作时应按规定要求佩戴防护器具；所用试剂及分析后的样品需回收并进行安全处理。适用范围本标准规定了测定水中12种磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类抗生素的液相色谱-三重四级杆质谱法。本标准适用于地表水、地下水和废水中磺胺间甲氧嘧啶、磺

4、胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶；诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氟罗沙星；脱水红霉素、罗红霉素、螺旋霉素的定性和定量检测。当富集水样体积为500ml,浓缩后定容体积为1.0ml,进样体积为20“时，固相萃取的方法检出限范围为0.7ng/L6.9ng/L,测定下限范围为2.8ng/L27.6ng/L，详见附录A。规范性引用文件本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件,其有效版本适用于本标准。HJ/T91地表水和污水监测技术规范HJ/T164地下水环境监测技术规范方法原理水样调节pH为2.04.0左右,经滤膜过滤除去颗粒物,水样中的抗生素类化合物经固相萃取柱富集

5、净化,采用液相色谱-三重四极杆质谱法分离检测。采用电喷雾正离子模式电离，多反应监测（MRM）方式，根据目标化合物的保留时间和特征离子峰定性，内标法定量。干扰与消除在本方法规定的条件下，为防止金属离子与抗生素结合形成络合物，干扰固相萃取过程，降低此类化合物的提取效率。可向水样中加入乙二胺四乙酸四钠，抑制金属离子的干扰。水中余氯等其他具有氧化性的有机物会干扰磺胺类抗生素的测定，可向水中（按0.5L计）加入150mg抗坏血酸去除干扰。试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的不含目标化合物的纯水。盐酸：P（HC1）=1.189g/ml,分析纯。硫酸：P（H2SO

6、4）=1.84g/m,分析纯。乙腈（CH3CN），色谱纯。甲醇（CH3OH），色谱纯。甲酸（HCOOH）：色谱纯。5.6乙二胺四乙酸四钠（Na4EDTA），分析纯。5.7抗坏血酸（C6H8O6）。6865.8盐酸溶液：量取50ml盐酸（5.1），缓慢加入到纯水中，待温度降至室温后，用纯水定容到100ml。5.9硫酸溶液：c（H2SO4）=4.0mol/L。量取22ml硫酸（5.2），缓慢加入到纯水中，待温度降至室温后，用纯水定容到100ml。pH=2.0去离子水：用盐酸（5.8）溶液调节去离子水至pH=2.0。0.1%甲酸去离子水溶液：量取0.5ml甲酸（5.5），缓慢加入到纯水中，待温度降至

7、室温后，用纯水定容到500ml。甲醇/乙腈混合溶液：1+1。0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液：量取0.5ml甲酸（5.5），缓慢加入到甲醇/乙腈混合溶液（5.12）中，用甲醇/乙腈混合溶液定容到500ml。稀释溶剂：0.1%的甲酸去离子水溶液（5.11）/0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液（5.13），3+1。5.15抗生素标准贮备液：p=100mg/L（参考浓度）可直接购买有证标准溶液，也可用标准物质（纯度三95%）制备。贮备液在0C-4C避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。使用标准物质制备标准贮备液的参考方法：准确称取10.0mg抗生素类化合物标准物质，溶于100ml甲醇

8、（5.4）中，最终浓度为100mg/L。脱水红霉素可直接购买标准物质（纯度三95%）或者由红霉素制备，推荐的制备方法为：量取400pl100mg/L红霉素贮备液于20ml棕色瓶中，加入19.6ml甲醇（5.4），然后加入约10pl硫酸溶液（5.9）调pH至酸性，室温静置4h后完成转化过程，可于-10C以下避光保存2个月。5.16抗生素类化合物标准使用液：p1.0pg/ml（参考浓度）将12种抗生素类化合物标准贮备液（5.15）按需要用甲醇（5.4）稀释。标准使用液于-10摄氏度以下避光保存，保质期2个月。使用时应恢复至室温，并摇匀。5.17内标贮备液：p=200yg/ml（参考浓度）内标物为1

9、3C3Atrazine（阿特拉津）。内标可直接购买有证标准溶液，也可用标准物质（纯度三99%）制备。贮备液应在-10C以下避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。5.18替代物贮备液：p=200yg/ml（参考浓度）喹诺酮类回收率替代物为环丙沙星-d8、磺胺类回收率替代物为磺胺二甲氧嘧啶-d6、大环86内酯类替代物为脱水红霉素-d6。替代物可直接购买有证标准溶液，也可用标准物质（纯度三695%）制备。贮备液应在-10C以下避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。5.19内标使用液：2.0yg/ml（参考浓度）将内标贮备液（5.17）按需要用甲醇（5.4）

10、稀释。内标使用液于冷冻保存，保质期1个月。使用时应恢复至室温，并摇匀。5.20替代物使用液：2.0yg/ml（参考浓度）将替代物贮备液（5.18）按需要用甲醇（5.4）稀释。替代物使用液于冷冻保存，保质期1个月。使用时应恢复至室温，并摇匀。5.21固相萃取柱：填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）或同等柱效的萃取柱，规格为6ml/500mg。5.22滤膜：0.7gm玻璃纤维或其他材质等效滤膜。5.23滤膜：0.22gm聚四氟乙烯或其它等效滤膜。5.24氮气：纯度三99.99%。仪器和设备除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的A级玻璃器皿。固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。6.

11、2浓缩装置：自动氮吹浓缩仪或K-D浓缩器等性能相当的设备。6.3液相色谱/串联质谱仪：配有电喷雾离子化源（ESI）。6.4色谱柱：C18或等效反相高效液相色谱柱，参考规格为：50mm（长度）x4.6mm（内18径），1.8gm（填料内径）。6.5样品瓶：1000ml带聚四氟乙烯内衬垫瓶盖的棕色玻璃瓶。微量注射器：10yl、20yl、50yl、100yl、250yl。一般实验室常用仪器和设备。样品7.1样品的采集参照HJ/T91和HJ/T164的相关规定采集样品。用预先洗涤干净并干燥的磨口棕色玻璃瓶采集水样，样品采集时应充满样品瓶（6.5），不留空隙。样品保存水样于现场立即添加盐酸溶液（5.8）

12、调节样品pH为2.04.0左右，并加入150mg抗坏血酸（5.7）及0.25gEDTA（5.6），在0C4C冷藏避光保存，7天内分析完毕。试样制备样品预处理样品采用固相萃取法富集前，水样采用孔径为0.7gm的玻璃纤维膜（5.22）过滤。固相萃取法分别用5ml甲醇（5.4）、5ml去离子水、5mlpH=2.0去离子水（5.10）活化固相萃取柱（5.21），保证小柱柱头浸润。量取500ml水样，加入25.0gl替代物使用液（5.20），采用盐酸溶液（5.8）调节水样pH为2.04.0左右，水样以1015ml/min的流速通过小柱。用去离子水淋洗小柱，去除小柱上的EDTA。之后用氮气（5.24）吹扫

13、、干燥小柱。再用10ml甲醇（5.4）以5ml/min的流速洗脱小柱，洗脱液接收于收集管中。洗脱液经氮吹（5.24，注意保持液面微微波动）浓缩至0.5ml左右，加入内标使用液（5.19）25gl,用稀释溶剂（5.14）定容到1.0ml,过0.22gm有机滤膜后待测。空白试样制备以实验用水代替样品，按照水样处理（7.3）相同操作步骤，制备固相萃取法空白试样。分析步骤仪器参考条件液相色谱参考条件流动相：0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液（5.13,A相），0.1%甲酸去离子水溶液（5.11，B相）。梯度洗脱程序见附录B。流速：0.3ml/min。柱温：40C。进样体积：20gl。质谱参考条件离子源：电

14、喷雾离子源（ESI），正离子模式。毛细管电压：4000V,干燥气体温度：350C，雾化器压力：35psi干燥气体流速：10L/min。多离子反应监测方式（MRM），具体条件参见附录C。对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。仪器调谐按照仪器使用说明书在规定时间和频次内对液相色谱/串联质谱仪进行仪器质量轴和分辨率调谐校正，以确保仪器处于最佳测试状态。在仪器使用过程中，如发现仪器质量数出现明显偏差或灵敏度大幅度下降时，应立即重新对仪器进行质量轴和分辨率调谐。校准校准曲线的绘制取一定量抗生素类化合物标准使用液（5.16）、内标物（5.19）及替代物使用液（5.20）于2ml

15、进样小瓶中，制备不含原点的标准系列（至少5个浓度点），使抗生素类化合物及替代物的质量浓度分别为2.0卩g/L、5.0卩g/L、10.0卩g/L、20.0卩g/L、50.0卩g/L、100yg/L和200yg/L（参考浓度），内标的质量浓度为50yg/L（参考浓度）。由低浓度到高浓度依次对标准系列溶液进样，以标准系列溶液中目标组分的浓度为横坐标，以其对应的峰面积（或峰高）与内标物峰面积（或峰高）的比值和内标物浓度的乘积为纵坐标，建立校准曲线。线性回归方程、线性范围和相关系数详见附录。y=ax+b（1）式中：x-目标组分浓度，yg/Ly-目标组分和内标物的峰面积（或峰高）比值与内标物浓度的乘积a-

16、校准曲线斜率b-校准曲线截距液相色谱/质谱图图1目标物、替代物及内标物的液相色谱/质谱总离子流色谱图（浓度100|ig/L）注：1：磺胺嘧啶；2：氟罗沙星；3：氧氟沙星；4：诺氟沙星；5：环丙沙星-d8；6：环丙沙星；7：磺胺二甲嘧啶；8：磺胺间甲氧嘧啶；9：磺胺甲恶唑；10：螺旋霉素；10：11：磺胺二甲氧嘧啶；12：磺胺二甲氧嘧啶-d6；13：阿特拉津13C3；14：脱水红霉素；15：脱水红霉素-d6；16：罗红霉素测定试样测定按照与绘制标准曲线相同的仪器分析条件进行测定。8.3.1空白试验按与试样测定相同的仪器分析条件（8.1）进行空白试样（7.4）的测定。结果计算与表示目标化合物的定性

17、分析每种被测组分选择1个母离子和2个子离子进行监测。在相同的实验条件下，试样中待测组分的保留时间与标准样品中目标组分的保留时间比较，相对标准偏差的绝对值应小于2.5%；且待测样品谱图中，各组分定性离子的相对丰度（Ksam）与浓度接近的标准溶液谱图中对应的定性离子相对丰度（Kstd）进行比较，偏差不超过表1规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。12种抗生素类化合物、3种替代物及1种内标物的MRM谱图见附录D。KsamA2(2)式中：K-样品中某组分定性离子的相对丰度，%，sama2-样品中某组分定性离子对的峰面积（或峰高），A1-样品中某组分定量离子对的峰面积（或峰高）。Kstd=std

18、1式中：Ktd标准品中某组分定性离子的相对丰度，%,std-A-标准品中某组分定性离子对的峰面积（或峰高），std2A府标准品中某组分定量离子对的峰面积（或峰高）。std1表1定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差单位：%标准样品中某组分的定性离子的相对离子丰度（K丿stdKstd5020KstdW50101560000)2018012420d1iiA$66ib156)磺胺嘧啶定性(251.1-108)x1Q4W125327525225151.2510750.50.26-4I6?3iwiii5n?CountsvsAcquisitionTim磺胺二甲嘧啶定量(279-186)磺胺二甲嘧啶定性(27

19、9-156)ESIWRMFrag-lOO(hfCiD260(281IOOO0IO81000)201S0124200 xW*12m09-0.B-07-D.6-050.401020.1-iii4JiiilbI1!113141SCouncavsAcquisitionTime(min)磺胺间甲氧嘧啶定量(281.1-156.1)磺胺间甲氧嘧啶定性(281.1-108.1)0.9D.6101112131415CountsvsAcquisitionTimeImin)磺胺甲恶唑定量（254-156）磺胺甲恶唑定性（254-108）磺胺二甲氧嘧啶定量（311-156）磺胺二甲氧嘧啶定性（311-108）X10

20、2+ESIMRMFrag=114.0VCID21.0(316.3700-162.0000)2018012402.d2-11.8-11.6-1.4-1.2-20.6-0.4-_j_a-_nM-JIAJIIIIIIIIIIIIIII1234567891011121314Countsvs.AcouisitionTime(min)x1022.62.42.21.81.61.41.20.80.S0.40.2+ESIMRMFrag-1140VCID290(3163700-1080000)2018012402d1niiiiiiiiiiiii12345789101112131Countsvs.Acquisiti

21、cxiTim磺胺二甲氧嘧啶-d6定性（316.7-108）诺氟沙星定性(320-276.1)x1035.5JJ:0.；环丙沙星-d定量(340-314.1).；：匚8螺旋霉素定量(422.2-174)螺旋霉素定性(422.2-101)CourtsvskousibcriTeiw脱水红霉素-d6定性(722-164.1)脱水红霉素定量(716.5-158)脱水红霉素-d6定量(722-164.1)罗红霉素定量(716.5-158)xIO3凸MRMFfag=1U.WC1?0(2186(0-177.2CCCi45-35-iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii12345fi78910111213U

22、151617181920212213C3Atrazine定量T2T8.6-177.2)脱水红霉素定性(716.5-558)附录E（资料性附录）方法的精密度和准确度表E.1方法的精密度化合物测定值（Rg/L）加标浓度（Rg/L）总均值（Rg/L）实验室内相对标准偏差/%实验室间相对标准偏差/%重复性限r/（Rg/L）再现性限R/（Rg/L）磺胺嘧啶0.04000.0312.514.812.70.0090.0130.2000.1641.410.411.20.0330.0600.4000.3152.29.213.20.0520.13磺胺二甲嘧啶0.04000.03075.813.317.20.010

23、0.0170.2000.1672.014.012.70.0400.070.4000.3253.210.615.20.0660.15磺胺间甲氧嘧啶0.04000.03155.712.920.40.0090.0200.2000.1593.111.913.30.0420.0710.4000.2961.49.816.30.0580.15磺胺甲恶唑0.04000.03324.913.020.60.0110.0110.2000.1624.014.615.80.0460.0830.4000.3003.511.914.90.0680.14磺胺二甲氧嘧啶0.04000.03558.614.812.20.0110

24、.0160.2000.1593.413.412.80.0430.0690.4000.3142.510.78.40.0670.096氟罗沙星0.04000.03784.014.58.10.0100.0130.2000.1871.413.417.20.0520.100.4000.3493.413.412.60.0810.14氧氟沙星0.04000.0384.214.210.30.0110.0150.2000.1812.512.415.20.0400.0850.4000.3421.913.314.80.0810.16诺氟沙星0.04000.0393.013.213.80.0100.0180.2000

25、.1724.412.414.80.0460.0830.4000.3096.713.014.70.0860.15环丙沙星0.04000.03855.913.517.10.0110.0210.2000.1724.412.414.80.0460.0830.4000.3211.716.415.10.0920.16螺旋霉素0.04000.03273.215.313.60.0100.0160.2000.1743.78.615.90.0320.0830.4000.3470.912.312.10.0920.14脱水红霉素0.04000.04051.112.115.40.0110.0200.2000.1822.

26、312.916.70.0420.0930.4000.3433.913.58.10.0820.110罗红霉素0.04000.03872.016.515.20.0120.0200.2000.1821.610.316.00.0350.0870.4000.3541.713.810.60.0770.126表E.2方法的准确度化合物名称样品类型实际样品浓度（昭/L）加标浓度（昭/L）回收率范围/%p2s/%磺胺嘧啶地下水0.000.040066.491.175.517.2地表水0.000.20062.885.778.416.4生活污水0.000.20060.697.077.222.5工业废水0.000.4

27、0063.310288.029.1磺胺一甲嘧啶地下水0.000.040064.510176.327.3地表水0.000.20064.186.976.319.3生活污水0.000.20067.799.882.020.7工业废水0.000.40077.693.487.013.3磺胺间甲氧嘧啶地下水0.000.040066.810277.730.5地表水0.000.20063.092.879.830.3生活污水0.000.20063.292.376.819.4工业废水0.000.40070.411386.334.8磺胺甲恶唑地下水0.000.040066.397.281.530.0地表水0.000.20063.210381.829.5生活污水0.01910.20066.610185.030.5工业废水0.000.40070.992.177.816.0磺胺一甲氧嘧啶地下水0.000.040078.398.788.018.5地表