医学遗传学：实验三 人类染色体标本制备及核型分析

1、 人类染色体标本制备及核型分析一 实验目的掌握染色体标本制备的原理和实验过程理解染色体标本制备的意义重点难点 染色体标本制备的具体实验操作过程核型分析 染色体是细胞与分子联系的重要桥梁，在医学遗传学研究中被广泛重视及应用。尤其是染色体畸变有关的各类遗传病的研究使临床分析上了一个新的台阶。 染色体异常：数目异常 结构异常人类染色体制备的应用核型分析的前提：染色体显带、 非显带、 染色体脆性部位染色体畸变检测：数目、结构秋水仙素PHA二 实验原理外周血淋巴细胞大都处于G0或G1期，一般情况不分裂在有丝分裂原(如植物血凝素PHA)作用下，可转化为淋巴母细胞而开始进行有丝分裂短期培养后，加秋水仙素作用

2、于细胞有丝分裂前期，抑制或破坏纺锤体、微管形成，将细胞阻滞于分裂中期对细胞再做低渗、固定、滴片和染色处理，制片后即获得中期染色体标本，用于显微观察低渗处理：使细胞核膜吸水膨胀，染色体分散，易于 观察和统计，同时还能提高染色效果 （0.075mol/L氯化钾溶液）固定处理：使染色体保持良好的形态结构、防止 染色体弥散、丢失 甲醇 对组织细胞具有脱水、固定、硬化作用 冰醋酸 穿透力强可加强固定效果（3:1）三 实验器材与实验分组每两人一组10ml离心管 1支/小组细胞培养物 1瓶/2小组玻璃滴管 3支/小组低渗液、固定液 1瓶/2小组玻片 1张/人Giemsa染液 2瓶公用酒精灯 1个/小组废液杯

3、 1个/小组离心机、水浴锅 公用四 实验方法与实验步骤1. 取材与细胞培养（教学准备组完成）采集人新鲜静脉血无菌状态下按22滴全血/8 mL培养液接种(培养基中含有PHA)轻摇匀后置37恒温箱培养72h终止培养前2小时，加入秋水仙素，使 终浓度达到3ug/ml2.染色体标本制备每离心一次，弃去上清后，均用指腹将沉淀弹匀！收集细胞：1瓶培养物均分到2支离心管中 2300rpm离心6min，去上清(不吸到细胞沉淀， 约留300ul液体，指腹弹匀)；低渗处理：离心管中加入37预温的低渗液6ml，滴管吹吸 混匀(将滴管伸到液体下方，吸取液体，在液面 上方沿管壁缓慢吹出)，置37恒温水浴锅，水 浴30m

4、in后，每管加入8滴(约500ul)固定液预固定：在低渗液上方，沿管壁缓慢加入固定液(注 意观察，液面上方会变成黑色)，用滴管轻轻吸取上层液体，在液面上方沿管壁缓缓吹出，两三次后，再将滴管伸至液 面底部，吸取液体，沿管壁吹出；2300rpm，离心6分钟，弃上清，将沉淀用指腹弹匀； 固定： 加入6ml固定液，吹吸混匀，2300rpm离心6 分钟，弃上清，将沉淀用指腹弹匀，重复此 步骤(固定，吹吸，弹匀，加入6ml固定液)， 室温放置30min；重悬：将固定后的细胞离心，2300rpm离心6min， 弃上清，指腹弹匀，加入0.2-0.4ml固定液， 滴管轻轻混匀成细胞悬液，用于下面的制片 3.制片

5、 1) 滴管吸取细胞悬液，左手持载玻片(磨砂面在左边)，吸管管口距离载玻片约 4cm高度，从左到右迅速滴片， 第二滴盖住第一滴，第三滴盖住第二滴(一轮压一轮)，滴5-6滴，不超出右边玻璃，滴完后将玻片稍倾斜，在酒精灯上过火(因固定液易燃，所以将玻片稍倾斜置于酒精灯上即会出现蓝色火焰)，迅速将火焰吹灭，再过一次火，吹灭，将玻片置于载玻台上 第一滴第二滴第三滴第四滴第五滴2) 用滴管吸取姬姆萨染液，铺满整张玻片，染色5分钟左右。3) 染色后在自来水下冲洗玻片，风干，镜下观 察五 实验注意事项低渗液浓度与低渗的时间应掌握适当离心机使用注意配平，离心的速度不宜过高预固定和固定时，吹悬混匀动作要轻柔滴片

6、时，吸管距离载玻片的高度要控制好固定液含易燃成分，过火焰时防止手部烧伤第三军医大学基础部 人类染色体标本核型分析 Karyotypes: describe the chromosome count of an organism and what these chromosomes look like under a light microscope. Attention is paid to their length, the position of the centromeres, banding pattern, any differences between the sex chromosomes, and any other physical characteristics. 一个体细胞中的全部染色体，按其大小、形态特征(着丝粒的位置）顺序排列所构成的图像就称为核型 实验分组与实验器材一人一组镜油瓶、擦镜纸 一套/二组显微镜 一台/人染色体中期分裂相标本片 一张/人实验步骤 1 将染色体标本片置于显微镜载物台上2 低倍镜下选择染色体形态和分散良好的中期分裂相，移到视野中心，换至高倍镜3 高倍镜下观察染色体的形态特征，选取染色体形态清晰的分裂相，换至油镜4 油镜下计数约15个细胞的染色体数，选择较好的核型，手绘染色体图注意事项1 显微镜使用