细胞生物学：第十六章 细胞死亡与细胞衰老

1、第十六章 细胞死亡与细胞衰老 第一节 细胞死亡 第二节 细胞衰老死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。 一、细胞的死亡方式（一）细胞坏死（二）细胞凋亡（三）自噬研究发现，不论单细胞还是多细胞生物，细胞死亡往往是一个主动的有基因决定的自动结束生命的过程。由于受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以常常被称为细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）（一）细胞凋亡1、细胞凋亡的概念和特征1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞这些的溶酶体并未被破坏，

2、显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念， 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。形态学3个阶段：凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某 些

3、细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。整个过程最大的特点是质膜始终保持完整，内含物不发生细胞外泄露，不引发机体的炎症反应。细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180200bp特征性的DNA ladders 凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker2、细胞

4、凋亡生理意义：细胞凋亡对于多细胞生物的个体发育的正常进行，自稳平衡的保持、免疫耐受的形成、肿瘤监控等过程中都起着非常关键的作用。（1）清除有机体不再需要的细胞，而不引起炎症反应。（2）细胞的自然更新，清除被病原体感染的细胞（3）免疫细胞对靶细胞的攻击并引起死亡，也是基于细胞凋亡（4）细胞凋亡失调会导致疾病蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡，2）脊椎动物的神经系统的发育3）发育过程中手和足的成形过程4)细胞调亡的失调（不恰当的激活或抑制）细胞凋亡不足：ALPS（自身免疫性淋巴增生综合征）细胞过度凋亡将会导致免疫功能丧失，AIDS3、细胞凋亡的检测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：D

5、NA片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细 胞，同时又能观察细胞的周期状态。4、细胞凋亡的分子机制1）诱导细胞凋亡的因子物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等。Caspase依赖性细胞凋亡不依赖Caspase的细胞凋亡2） Caspa

6、seCaspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease（天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶），即CaspaseCaspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化秀丽隐杆线虫(Caenorbabditis Elegans)从胚胎发育到成体产生1090个细胞，其中131个细胞凋亡后消失，找到一系列与细胞凋亡有关的基因 ced-3、ced-4 诱发、启动凋亡， ced-9 抑制凋亡 ced-3、ced

7、-4 基因突变或缺失，使凋亡受阻 移入 ced-9 使凋亡受阻 失去 ced-9 使细胞凋亡Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme，白介素-1 -转换酶)，即Caspase1。ced-3 和ced-4是细胞杀手;ced-9可抵消ced-3和ced-4 的作用，防止细胞被杀死，因此是存活因子; 进一步的研究发现真正的细胞杀手是ced-3而不是ced-4。caspase家族成员基本功能Caspase1Caspase11 不直接参与细胞凋亡信号的传导Caspase4Caspase2Caspase8Caspase9Caspase10Caspase3

8、Caspase6caspase7参与细胞凋亡的起始对执行者的前体切割，产生有活性的执行者参与细胞凋亡的执行：切割结构蛋白和调控蛋白3）Caspase依赖性的细胞凋亡当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。下游Caspases活化后，作用底物： 裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体； 裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder; 裂解参与细胞连接或附着的

9、骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、 脱落，便于细胞吞噬； 导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。Bcl-2, Bcl-x, Bcl-w,抑制细胞凋亡，Bax,Bak,Noxa促进细胞凋亡，Bcl-2, Bcl-x与 Bax,Bak形成异二聚体，通过抑制Bax和Bak寡聚体化来抑制膜通道的开启。凋亡信号Bax,Bak聚集、转移到Mt膜上与VDAC作用通道开放，Cytc释放启动细胞凋亡）Caspase非依赖的细胞调亡）生死抉择：细胞凋亡的调控细胞中存在Caspase抑制因子，能够直接与Caspase 活性分子结合，抑制其底物的切割作用。如：c-IAP，BARIAP特异性地与执行Caspase-3

10、和Caspase-7的活化形式结合，发挥抑制作用XIAP,ILP-2和Linvin能抑制起始Caspase-9c-FLIP,BAR,ARC能够抑制死亡受体对Caspase-8的激活。IAP家族成员的抗凋亡作用也能被特异的抑制因子解除。凋亡启动后，Smac/DIABLO和Omi/HtrA2与Cytc一起从Mt中释放出来，与IAP结合并释放被IAP封闭的Caspase.天花病毒CrmA抑制Caspase-8杆病毒p35对大多数Caspase有较强的抑制作用。疱疹病毒和痘病毒c-FLIP,含有两个DED结构域，可与死亡受体Fas的接头蛋白FADD作用，阻止Caspase-8与FADD结合及活化，来抑

11、制凋亡。6）细胞凋亡的信号传导NF-kB是细胞核内的基因转录的调控因子它的靶基因是TRAF，IAPS等，这些基因的表达蛋白能抑制Caspase8的活性从而抑制细胞凋亡。Ras活化NF-Kb， NF-kB通过调控靶基因表达蛋白，抑制Caspase8的活性，从而抑制细胞凋亡。p53是肿瘤抑制基因，可以阻断细胞周期和诱导细胞凋亡。长期以来人们认识到细胞在DNA损伤后便停止DNA复制，这是P53蛋白表达、聚集并进一步上调一系列基因表达的结果。 P21便是其中之一, P21具有抑制细胞周期素/细胞周期素依赖性激酶的底物磷酸化作用，导致G1期阻滞，使细胞赢得时间，在进入S期前修复损伤的DNA。 如果损伤不

12、能修复，P53就激活那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞进入凋亡状态。当P53基因发生缺失或异常时，P53失去对细胞的监视作用，带着损伤的DNA进入S期，其结果是细胞因遗传不稳定性而产生突变和染色体畸变，最后导致细胞癌变。 ，P53基因产物诱导细胞凋亡，可提供一种防护机制，使DNA损伤的细胞不能存活，而走向程序性死亡。（二）细胞坏死：可能是细胞程序性死亡的另一种形式。坏死的早期阶段,染色体形成串状片段,细胞器膨胀 ，坏死的最后阶段,细胞膜破裂,细胞解体,内容物散逸。（三）细胞自噬：细胞中出现大的来自内质网或细胞质中双层膜包裹的自噬泡，成为自噬小体。自噬小体包裹着整个细胞器和部分细胞质，且与容酶体

13、融合后，内含物被容酶体中的水解酶消化。二、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡（一）植物细胞的程序性死亡1）概述：导管的分化、通气组织的形成，糊粉层的退化，绒毡细胞的死亡，胚胎发育过程中胚柄的退化，单性植物中花器官的程序性退化等过程以及对环境胁迫的反应，均存在细胞程序性死亡。另细胞在受到某些真菌或细菌感染后主动、快速死亡，也是细胞的程序性死亡2）特征：死亡细胞的残余物被细胞壁固定在原位。在过敏反应中：染色质凝缩，DNA降解为50kb片段，细胞质膜与液泡膜皱缩破裂，质壁分离，内涵物泄露。管状细胞分化：细胞壁增厚，液泡膜破裂，核 DNA被迅速降解，内涵物被水解，最后仅剩下细胞壁。3）诱导因素：活性氧和植

14、物激素（二）酵母细胞的程序性死亡1）特征：DNA凝聚、边缘化和断裂，Cytc从Mt中的释放。Yca1的缺失降低了酵母细胞对凋亡诱导因子的敏感性。Nma111在核内聚集，引发凋亡。“主动自杀”清除适应不良的个体以及控制群体数量，第二节 细胞衰老一、细胞衰老的概念及特征 现代人类面临着3种衰老：生理性衰老病理性衰老心理性衰老 衰老(senescing，aging)是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现,是不可逆的生命过程。人的衰老与细胞的衰老相关联。Hayflick界限概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的 寿命；它们的增殖能力不是无

15、限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick界限癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态 已经不同于原先的细胞。细胞来源人胚肺成纤维细胞中年人成纤维细胞老年人成纤维细胞可增殖代数 40-60 20 2-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数体外培养成纤维细胞来自胎儿： 可传代 50 次 （与供体年龄 来自成人； 可传代 20 次 有关）来自小鼠： 可传代 1428 次 （与供体物种来自乌龟： 可传代 90125 次 特性有关）物种的寿命与体外培养时细胞传代次数的关系 Hayflick的一些经典实验1、 从胎儿肺取到的成纤维细胞可在体外培养条件下传代50次。而从成人肺取到的成纤维

16、细胞只能传代20次，可见细胞的增殖能力与供体的年龄有关。2 、1961年Hayflick等观察到在人二倍体成纤维细胞体外连续培养时，增殖能力有一定限度。正常细胞培养到一定时期，会出现生长停滞，渐渐失去有丝分裂的能力并在细胞内积累大量碎片和颗粒，最终难免死亡。海弗立克认为这是人的寿命在细胞水平的表示。Hayflick还比较取自寿命长度不同的生物的胚成纤维细胞在体外培养条件下的传代次数和寿命的关系，发现物种寿命与培养细胞寿命之间存在着确定的相互关系。3、 早老症病人细胞培养只传代2-4次4、用巴氏小体做标记老男和少女细胞的培养，证明细胞内部决定衰老5 、胞质体和完整细胞的融合实验 证明是细胞核决定

17、衰老Hayflick得出这样的结论细胞、至少是培养的细胞，不是不死的而是有一定寿命的。它们的增殖能力不是无限的，而是有一定界限的。这就是有名的Hayflick界限。细胞在体内条件下的衰老在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在 个体发育的早期也会发生;人体和动物的各种器官和组织都是由细胞组成的，整体水平的老化是机体各部分组织细胞老化的总的反映。从五官的感觉功能的老年性退化，如人眼的视力调节能力随年龄而降低，到老年性疾病引起死亡率的提高，如肾、心、脑组织中血管的故障、骨质疏松、肺功能和免疫功能的缺陷等等，都是以细胞发生的变化为基础的。一名男子从 36 岁到 75 岁味觉丧失 64肾小球减少

18、 44肾小球过滤率减少 31脊神经元减少 37神经传导速度减慢 10脑供血量减少 20肺活量减少 441 小鼠的表皮移植表皮移植7-8年，说明体内环境因素影响了细胞的寿命2 骨髓移植说明骨髓干细胞的衰老至少是缓慢的（一）衰老过程中细胞核的变化在衰老变化中细胞核结构的最明显变化是核膜内折。电镜检测可见衰老细胞核形状不规则、内陷和断裂。在体内细胞中也观察到核膜的不同程度的内折，神经细胞尤为明显，这种内折随年龄增长而增加，最后可能导致核膜崩解。染色体固缩化是衰老细胞核中另一个重要变化。在衰老细胞中，细胞核固缩，还常常出现核内容物，核质染色加深，核的细致结构逐渐消失，核仁也发生明显的变化。 （二）内质

19、网的变化在衰老细胞中，内质网排列变得无序，膜腔膨胀扩大甚至崩解，膜面上核糖体数量减少。（三）衰老过程中线粒体的变化 多数研究工作表明，细胞中线粒体的数量随着年龄的增大而减少，而其体积则随着年龄的增长而增大。衰老的神经元，肝脏细胞和肌细胞的线粒体数目减少，但体积增大。同时，线粒体的结构也发生变化，肿胀空泡化，内部嵴大大减少。线粒体崩解是细胞衰老变化的重要标志。线粒体变化主要是自由基损伤的结果，因为线粒体的呼吸链是损伤性自由基的发源地。线粒体DNA成为自由基的主要攻击目标，使线粒体DNA呈逐渐减少或使线粒体DNA的转录产物逐渐减少，直接影响与线粒体呼吸和能量转换过程有关的蛋白质的合成，造成ATP合

20、成和细胞能量供应不足，引起细胞功能紊乱，直到细胞死亡。 （四） 致密体的生成是衰老细胞中常见的结构。（五）膜体系的变化1、细胞的间隙连接明显减少，组成间隙连接的膜内颗粒聚集体变小，这种变化使细胞间代谢协作减少了。2、细胞膜上的微绒毛数目增加，补偿了衰老时细胞间联系的衰退，以利于保持内环境的稳定。3、膜脂相发生改变，不饱和脂肪酸含量增加，膜流动性下降。年轻的功能健全的细胞膜是典型的液晶相，膜中脂肪酸链能自由移动，每个脂类分子与其相邻分子之间的位置交换极其频繁，镶嵌于其中的蛋白分子表现出最大的生物学活性。衰老的或有缺陷的膜通常处于凝胶相或固相，由于磷脂的脂肪酸尾不饱和程度增加而被“冻结”了，脂分子

21、移动很慢或完全不能自由移动。因此镶嵌于其中的蛋白质也就不能再运动了，从而干扰了膜蛋白的正常结构与功能。衰老细胞膜发生脂质过氧化反应，流动性明显降低，因而细胞的兴奋性降低，离子转运的效率下降以及对内源性和外源性刺激的反应性也随之降低。膜的微粘度增加，从而影响膜表面受体的移动和特异性生物化学信号的传导。二、细胞衰老的分子机制 细胞的衰老（senescence）现在关于细胞衰老的分子机制的研究，引起人们关注的有染色体端粒复制和线粒体自由基的假说。（一）复制衰老的机制发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的 “有丝分裂钟”学说（Harley,1990）端粒是由简单的富含T和G的DNA片段的重复序列组成。人类端粒结构为染色体末端重复上千次的TTAGGG序列所组成。DNA聚合酶不能完成线性染色体末端DNA的复制，由于RNA引物的原因，DNA聚合酶一定会留下染色体末端的一段DNA（一段端粒）使其不被复制。那么真核细胞染色体末端的端粒就会随着细胞分裂而缩短。这个缩短的端粒传给子细