八棱海棠遗传多样性和亲缘关系的TP

1、八棱海棠遗传多样性和亲缘关系的TP论文摘要：利用TP-M13-SSR的方法对河北收集的八棱海棠资源的遗传多样性和亲缘关系进行研究。16对TP-M13-SSR引物对34份材料进行扩增出205个等位基因，平均每个位点12.8个等位基因。分析结果说明，除山荆子、海棠花和绵苹果外的31份八棱海棠材料的遗传系数为0.7879，平均位点杂合度为0.8413，平均多态性信息含量为0.7592；河北怀来的八棱海棠与海棠花、山荆子的相似系数高于小矾山和大古城产地，其与山荆子和海棠花的亲缘关系可能要近于后两者；三块石海棠1与绵苹果的相似系数最高，在起源演化上可能要晚于其他的海棠类型；系统聚类分析结果显示，所有供试

2、材料主要分为两大类，与起源演化相关，第一类为野生种海棠花和山荆子，第二类主要为绵苹果和八棱海棠的各地方类型品种。河北怀来可能是八棱海棠主要的原始起源地区，与其他地区相比，小矾山地区八棱海棠与其亲缘更近。论文关键词：八棱海棠,遗传多样性,亲缘关系八棱海棠，又叫怀来海棠，原产于怀来县，可能是山定子和海棠果的杂交种，有千余年的栽培历史。其树体具有结果早、产量高、适应性广、抗性强和与栽培品种的亲和性好等特点；而果实那么具有果形美、色泽好、含糖量高、耐贮运、口味佳等优点，既可以生食，也是加工的好原料。因此八棱海棠既可以用作砧木又可以用作水果生产，也因此而成为目前中国应用最广泛的苹果砧木之一。八棱海棠因是

3、实生繁殖，其类型很多，如冷海棠、热磙子、六轴滚海棠、圆海棠、牛妈奶海棠、平顶海棠、热海棠等，以往对于八棱海棠的研究多注重于提高其抗性以作砧木利用方面，但对于八棱海棠的遗传多样性和亲缘演化关系研究甚少。本研究针对河北不同地区收集的局部八棱海棠资源进行TP-M13-SSR的遗传多样性和亲缘关系分析，旨在为今后八棱海棠资源的进一步收集和鉴定评价提供根底，并为其利用和种质开发等提供理论依据。1材料与方法1.1材料试验材料取自河北怀来、大古城、小矾山、三块石等八棱海棠的密集分布区，共计31份；此外，山定子、海棠果和绵苹果那么取自中国农业科学院果树研究所国家果树种质兴城苹果资源圃。材料名称及编号见表1。表

4、134份供试苹果材料Table134materialsforTP-M13-SSRanalysis 编号 code 材料名称 Material name 学名 Book name 1 海棠花Haitanghua M.prunifolia(Willd.)Borkhausen 2 绵苹果Mianpingguo M.domestica Borkh. 3 山荆子Shanjingzi M.baccata(L.)Borkh 4 怀来八棱海棠Huailaibalenghaitang M.robusta Rehd. 5 河北八棱Hebeibaleng M.robusta Rehd. 6 大古城八棱海棠实生Dag

5、uchengbalenghaitangshisheng M.robusta Rehd. 7 小矾山八棱Xiaofanshanbaleng M.robusta Rehd. 8 小矾山八棱1号Xiaofanshanbaleng1hao M.robusta Rehd. 9 紫色小矾山八棱Zisexiaofanshanbaleng M.robusta Rehd. 10 小矾山八棱海棠实生Xiaofanshanbalenghaitangshisheng M.robusta Rehd. 11 小矾山海棠2号Xiaofanshanhaitang2hao M.robusta Rehd. 12 小矾山海棠2号实

6、生Xiaofanshanhaitang2haoshisheng M.robusta Rehd. 13 沁源滦庄沙果Qinyuanluanzhuangshaguo M.robusta Rehd. 14 滦庄沙果实生Luanzhuangshaguoshisheng M.robusta Rehd. 15 平顶海棠Pingdinghaitang M.robusta Rehd. 16 河北平顶海棠实生Hebeipingdinghaitangshisheng M.robusta Rehd. 17 红海棠Honghaitang M.robusta Rehd. 18 冷海棠Lenghaitang M.robu

7、sta Rehd. 19 冷海棠实生Lenghaitangshisheng M.robusta Rehd. 20 小矾山海棠4号Xiaofanshanhaitang4hao M.robusta Rehd. 21 小矾山海棠实生Xiaofanshanhaitangshisheng M.robusta Rehd. 22 三块石海棠1号Sankuaishihaitang1hao M.robusta Rehd. 23 三块石海棠2号Sankuaishihaitang2hao M.robusta Rehd. 24 三块石海棠1号实生Sankuaishihaitang1haoshisheng M.robu

8、sta Rehd. 25 三块石海棠2号实生Sankuaishihaitang2haoshisheng M.robusta Rehd. 26 短枝磙子Duanzhigunzi M.robusta Rehd. 27 短枝磙子实生Duanzhigunzishisheng M.robusta Rehd. 28 热磙子Regunzi M.robusta Rehd. 29 热磙子实生Regunzishisheng M.robusta Rehd. 30 光面磙子实生Guangmiangunzishisheng M.robusta Rehd. 31 早白海棠Zaobaihaitang M.robusta R

9、ehd. 32 晚白海棠Wanbaihaitang M.robusta Rehd. 33 晚白海棠实生Wanbaihaitangshisheng M.robusta Rehd. 34 玲铛果Lingdangguo M.robusta Rehd. 1.2实验方法及数据处理采用德国QIAGEN的DNeasyPlantMiniKit提取供试材料的基因组DNA。本实验选用的30对普通的SSR引物序列均来源于Yamamoto等、R.Liebhard等报道的序列，TP-M13-SSR引物由上海生工生物工程技术效劳合成，5端带有荧光标记的M13正向引物 Primer Sequence M13-B 6FAMT

10、M 56FAMTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 M13-G VICTM 5VICTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 M13-Y NEDTM 5NEDTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 参照Schuelke Forward Primer Sequence 反向引物序列 Reverse Primer Sequence 退火温度 Annealing temperature () KA4b F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-AAA GGT CTC TCT CAC TGT CT R:CCT CAG CC

11、C AAC TCA AAG CC 48 BGT23b F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-CAC ATT CAA AGA TTA AGA T R:ACT CAG CCT TTT TTT CCC AC 50 CH01f03b F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GAG AAG CAA ATG CAA AAC CC R:CTC CCC GGC TCC TAT TCT AC 58 CH02b121 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GGC AGG CTT TAC GAT TAT GC R:CCC ACT AAA AGT TCA CAG

12、 GC 59 CH03d07 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-CAA ATC AAT GCA AAA CTG TCA R:GGC TTC TGG CCA TGA TTT TA 51 CH04e03 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-TTG AAG ATG TTT GGC TGT GC R:TGC ATG TCT GTC TCC TCC AT 60 CH04h02 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GGA AGC TGC ATG ATG AGA CC R:CTC AAG GAT TTC ATG CCC AC 55.5 CH

13、05c06 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ATT GGA ACT CTC CGT ATT GTG C R:ATC AAC AGT AGT GGT AGC CGG T 58 CH05d08 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-TCA TGG ATG GGA AAA AGA GG R:TGA TTG CCA CAT GTC AGT GTT 55.5 CH02a04 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GAA ACA GGC GCC ATT ATT TG R:AAA GGA GAC GTT GCA AGT GG 58 CH05b

14、06 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ACA AGC AAA CCT AAT ACC ACC G R:GAG ACT GGA AGA GTT GCA GAG G 55 CH05d04 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ACT TGT GAG CCG TGA GAG GT R:TCC GAA GGT ATG CTT CGA TT 60 CH01f07a F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CCC CTA CAC AGT TTC TCA ACC C R:CGT TTT TGG AGC GTA GGA AC 59 CH04g07 F:

15、CAC GAC GTT GTA AAA CGA CCC CTA ACC TCA ATC CCC AAT R:ATG AGG CAG GTG AAG AAG GA 57 CH05e04 F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CAA GGA GAA GAC CGT GTG AAA TC R:CAT GGA TAA GGC ATA GTC AGG A 57 CH05h12 F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CTT GCG GAG TAG GTT TGC TTT R:TCA ATC CTC ATC TGT GCC AA 60 2.2品种鉴定和遗传多样性分析表416个SS

16、R位点在31份八棱海棠资源上检测到的遗传多样性Table4Geneticdiversityof31cultivarsofMalusrobustaRehd.revealedby16SSRprimers 标记 Marker 主等位基因频率 基因型数Genotype No. 等位基因数Allele No. 基因多样性 Gene Diversity 杂合度Heterozygosity 多态性信息含量PIC KA4b 0.4138 9 5 0.7063 0.4138 0.6589 BGT23b 0.5161 3 2 0.4995 0.7097 0.3747 CH01f03b 0.3387 13 7 0.

17、7784 0.9355 0.7468 CH02b12 0.2258 19 12 0.8512 0.8065 0.8349 CH03d07 0.4516 13 12 0.7279 0.9677 0.6975 CH04e03 0.2097 20 15 0.8720 0.9355 0.8595 CH04h02 0.2167 22 17 0.8856 0.9667 0.8758 CH05c06 0.3103 17 15 0.8199 0.9655 0.7998 CH05d08 0.2742 15 11 0.8137 0.7419 0.7892 CH02a04 0.3548 16 13 0.7981 0

18、.8710 0.7755 CH05b06 0.3226 17 20 0.8377 0.9677 0.8233 CH05d04 0.4516 14 12 0.7409 0.8387 0.7168 CH01f07a 0.2321 19 15 0.875 0.8571 0.8636 CH04g07 0.2903 18 14 0.8304 0.8065 0.8118 CH05e04 0.2581 19 14 0.8632 0.7742 0.8499 CH05h12 0.4516 11 9 0.7076 0.9032 0.6694 平均 Average 0.3324 15.3 12.1 0.7880 0

19、.8413 0.7592 图1TP-M13-SSR所检测的苹果不同品种在SSR位点CH01f03b的指纹图谱Chart1ThefingerprintingrevealedbyTP-M13-SSRindifferentapplecultivarsatCH01f03b2.3亲缘与聚类分析收集的八棱海棠的野生资源经实生繁殖后变异极明显，例如：小矾山八棱海棠与小矾山八棱海棠实生的相似系数为0.8098，冷海棠和冷海棠实生的相似系数为0.7610，三块石海棠1与三块石海棠1实生相似系数为0.7268。根据16对引物的扩增数据，对所有供试的34份材料，以Dice相似系数采用UPGMA聚类见图2，在相似系数

20、0.77处将所有供试材料主要分为两大类，与起源演化相关。第一类为野生种海棠花和山荆子；第二类主要为八棱海棠的各海棠品种，其又包含三个小类。第一小类主要为绵苹果、三块石海棠、晚白海棠以及八棱海棠的各地方类型，其应是最接近于栽培品种；第二小类主要为冷海棠、热磙子、红海棠和早白海棠，其在演化上可能要先于第一小类，而其中又以红海棠与热磙子相似系数最高；第三小类主要为怀来八棱、小矾山八棱、小矾山槟子、三块石海棠2和铃铛果，其在演化上可能又要先于第二小类。河北怀来可能是八棱海棠主要的原始起源地区，与其他地区相比，小矾山地区八棱海棠与其亲缘更近。图2八棱海棠、山定子、海棠果和绵苹果的聚类分析树状图3讨论TP

21、-M13-SSR的方法是基于荧光测序技术的SSR扩增产物检测体系，通过普通的SSR引物与M13荧光引物的结合，实现SSR扩增产物的快速检测，准确获得不同SSR位点的扩增产物的片段大小，使机器自动收集、分析数据代替了银染方法的人工读取胶板的繁琐工作，在很大程度上降低了系统误差。其在玉米和高粱等作物中已经得到很好的应用，在本实验中的成功应用也证明其可以应用到苹果种质资源的遗传多样性和亲缘关系研究中。本实验中紫色小矾山八棱和小矾山海棠4的结果完全相同，可能是由于两者的差异极小，利用现有的16个SSR检测位点缺乏以检测出两者的差异，因此，如要仅以揭示两者的差异，需进一步增加SSR检测位点的量。此外，引

22、物KA4b和BGT23b为梨SSR引物，其在本实验的研究中也得到了很好的应用，证明了在TP-M13-SSR的技术体系中苹果和梨的SSR引物具有很好的通用性，进一步地吻合了SSR引物在蔷薇科内具有一定的通用性的结论。河北怀来的八棱海棠与海棠花和山荆子的相似系数最高，均高于小矾山和大古城等地的八棱海棠与海棠花和山荆子，其与山荆子和海棠花的亲缘关系可能要近于后两者。山西、河北300多年前是苹果栽培种中，中国苹果即绵苹果的最适分布区，华北曾形成绵苹果的次生中心，而三块石海棠1与绵苹果的相似系数最高，在起源演化上可能要晚于其他的海棠类型。河北怀来可能是八棱海棠主要的原始起源地区，与其他地区相比，小矾山地

23、区八棱海棠与其亲缘更近。本实验中经过TP-M13-SSR检测，所有原生境收集的八棱海棠野生资源经过实生繁殖后成活的植株均较原株有较大变异。因此，要收集和保存野生八棱海棠苹果资源，最好采用嫁接的方法进行繁殖保存。假设采用实生繁殖的方法，多大的遗传群体可以最大限度的保持野生原株的遗传完整性是急需要解决的问题。八棱海棠的实生变异明显加之自然杂交融合，经过复杂的繁衍和演化，形成了河北八棱海棠的复杂分布和系谱，研究和保持其遗传多样性并对其加以利用将具有重要的意义。从分子角度为八棱海棠的起源和演化过程提供一定的理论依据。参考文献1 CHEN Jing-xin. Apple topography of He

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27、cloning of MrACT from Malus robusta.M and genetic transformation of glucoseoxidase gene from Aspergillus niger. Nanjing, Nanjing AgriculturalUniversity,2021.8 YAMAMOTO T, KIMURA T, SAWAMURA Y, MANABE T, KOTOBUKI K, HAYASHI T, BAN Y, MATSUTA N. Simplesequence repeats for genetic analysis in pear. Eup

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