DB21∕T1887-2011猪瘟鉴别诊断技术规范

1、DB21/T 1887-2011猪瘟鉴别诊断技术规范B41DB21辽宁省地点标准DB 21/ T18872011猪瘟野毒株与疫苗株鉴别诊断技术规范Techniques specification for detection and differentiation of wild-type a nd vaccine viruses of Classical Swine Fever virus点击此处添加与国际标准一致性程度的标识2011 - 01 - 17 公布2011 - 02 - 01 实施公布辽宁省质量技术监督局（报批稿）、，.刖百猪瘟野毒株与疫苗株鉴别诊断技术规范范畴本标准规定了猪瘟临床

2、诊断、 病理学诊断、 常规病原学诊断试验以及CSFV 野毒与兔化弱毒疫苗株的复合荧光定量RT-PCR 的鉴别诊断技术方面的要求。本标准适用于辽宁省生物安全n级（BSL-2）以上实验室对猪瘟野毒株与疫苗株的鉴别诊断。规范性引用文件下列文件关于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。猪瘟诊断技术GB/T 16551-2008中华人民共和国动物防疫法临床诊断按 GB/T16551-2008 2.2进行。病理学诊断按 GB/T16551-2008 2.3进行。常规病原学诊断试验对临床及病理学诊断的

3、可疑患猪进行病原学诊断，实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行免疫酶染色试验按 GB/T16551-2008 3.2进行。直截了当免疫荧光抗体试验按 GB/T16551-2008 3.4 进行。猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）按 GB/T16551-2008 3.5进行。复合荧光定量RT-PCR鉴别诊断试验引物和探针应用MegAlign软件对GenBank中公布的34株CSFV（包括23株国内 外不同基因型的野毒株和11株弱毒疫苗株）和其它瘟病毒（包括BVDV-1,BV DV-2和BDV共4株）基因组序列进行比对分析，在高度保守的 5-UTR内 设计了针对CSFV的通用

4、上下游引物CSFV-F和CSFV-R（预期扩增产物大小 为98-99bp）以及不同荧光基团标记的CSFV野毒特异性探针（CSFVw ）和 猪瘟兔化弱毒疫苗株特异性探针（CSFVv）（表1 ）,引物和探针由宝生物工程 有限公司合成。复合荧光定量RT-PCR引物和探针序列及两端标记情形名称序列T 值(C)基因组位置（bp）CSFV F5-GAACTGGGCTAGCCATG-357.0186-102CSFV R5-ACTGTCCTGTACTCAGGAC-357.56166-184CSFVw5-FAM-AGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCG-TAMARA-368.08111-137CS

5、FVv5-TET-TAGGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGCCA-TAMARA-366.27110-138按照猪瘟病毒石门株（GenBank No. AF092448 ）基因组位置材料预备除专门讲明外，本规范所用试剂均为分析纯，本试验所用试剂需用无 R NA酶污染的容器分装；各种离心管和带滤芯吸头需无 RNA酶污染；剪刀、 镣子和研钵器均宜经干烤灭菌。样品采集濒死猪、扑杀猪及流产胎儿取扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏；待检活 猪，用注射器抽取猪血2mL4mL。样品处理按1: 5 （质量浓度）比例，取待检组织和 0.04mol/L PBS （pH72PH7. 4）液于研钵中充分研磨制成组织

6、匀浆液， 4c 1000 g离心15 min,取上 清液转入无RNA酶污染的离心管中，备用。全血采纳脱纤抗凝备用。细胞培养物冻融3次备用；其他样品酌情处理。制备的样品在2C8c储存不应超过24 h,长期储存应小分装后置-7 0 c以下，幸免反复冻融 同时设阴、阳性样品对比。病毒 RNA 提取用 Trizol 试齐1Molecular Research Center, Inc.)提取样品总 RNA。移取 750 区 L Trizol 至 1.5 mL Eppendorf 管，加入 200 L 血液(培 养液或组织处理上清液)，漩涡振荡20 s,室温下作用5 min。加入250L三氯甲烷，漩涡振荡

7、15 s,室温下作用10 min。以 12000 r/min ( 11750g) ， 4 离心 15 min。轻轻吸取上清转至新的1.5 mL Eppendorf管(注意不要吸到中间蛋白 层)，约550 wL600 wL,加入等量预冷的异丙醇，颠倒数次混匀，-20C 条件下静置许多于 10 min。以 12000 r/min ( 11750g) ， 4 离心 15 min。轻轻倒掉上清，顺势将管口残液在吸水纸上蘸干(注意各管不要用吸水纸同一点) ，向管中轻轻加入 1 mL 预冷的75%乙醇。轻轻颠倒数次，将乙醇倒掉，将管口残液在吸水纸上蘸干(注意各管不要用吸水纸同一点) ，盖上盖后，以 500

8、0 r/min ， 4离心2 min 。用清洁无酶吸头将管底乙醇吸干，注意不要吸走沉淀，将残留乙醇晾干，直至无乙醇味。力口 50L DEPC水溶解RNA , -70 C储存备用。cDNA 合成取RNA 2L,加入到30区L反转录反应体系中，内含5XRT Buffer 6i L, dNTP(各 10mmol/L ) 1 L 9-mer随机引物 50pmol、禽源反转录酶 (AMV RTXL) 10U 和 RNA 酶抑制齐1J (HPRI) 20U, 42c水浴 1h,最后 70c 15min 灭活反转录酶，置-20备用。复合荧光定量RT-PCRXt CSFV野毒株和猪瘟免化弱毒疫苗株的鉴别检 测

9、反应体系 25区 L,其中含 cDNA 1 wL、10X EX Taq Buffer 2.5 区 L、d NTP(各 2.5mmo1/L ) 2L、MgCl2 (2.5mmo1/L) 7L、CSFV-F(10i mo1/ L)和 CSFV-R(10w mo1/L)各 1 L、CSFVw (10mo1/L)ffl CSFVv (10 m o1/L)各 0.5 L、Hot Start EX Taq (5U/L) 0.2 L,去离子水 9.3 L。反应条件为：95 5min，95 10s， 60 45s； 40个循环，退火延伸时收集荧光信号。结果判定结果分析条件设定读取检测结果，阈值设定原则以阈值线

10、刚好超过正常阴性对比扩增曲线的最高点。质控标准阴性对比的检测结果应没有特异性扩增， 阳性对比的 Ct 值应小于 30.0。结果描述与判定阳性检测到标记荧光素FAM的Ct值小于等于30.0,显现明显S形扩增曲 线，而标记荧光素TEM的Ct值也小于等于30.0,也显现明显S形扩增曲 线，表明该样品中既存在猪瘟野毒株，也存在猪瘟疫苗毒株；仅检测到标记荧光素FAM的Ct值小于等于30.0,显现明显S形扩增曲线，表明该样 品中仅存在猪瘟野毒株； 仅检测到标记荧光素 TEM 的 Ct 值小于等于30.0，显现明显 S 形扩增曲线，表明该样品中仅存在猪瘟疫苗毒株。阴性无 Ct 值同时无扩增曲线，表明样品中无猪瘟病毒。有效原则Ct 值大于 30.0 的样本须重做， 重做结果无 Ct 值者为阴性， 否则为阳性。（资料性附录）附录 APBS （磷酸盐缓冲液）的配制0.1mol/L PBS TOC o 1-5 h z 氯 氯化钠（NaCI）80.0g氯化钾（KCI）2.0 g十二水磷酸氢二钠（NaHPQ 12Ho30.0 g磷酸二氢钾（KH2PO4 ）2.0 g蒸馏水1000.0mL0.04mol/L PBS（ PH7.2 7