药品微生物检验及无菌检测

1、药品微生物检验及无菌检测地址：北京市天坛西里2号 邮编：100050 蒲公英论坛：1药品微生物检验特点及过程控制药品因素环境影响培养观察抽样检查破坏试验方法验证（氟康唑）过程控制2无菌/微生物限度检查理念环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断3一、实验设施实验室系统操作环境关键设备对照培养基物 质 保 障4（一）、实验室系统洁净实验条件有效性：整体10000级、局部100级。安全性：保护样品、人员和环境。可操作性：方便、快捷、顺畅。洁净实验条件的维护、验证阳性菌实验室达到P2生物安全标准5（一）、实验室系统实验室系统的管理与维护：1、屏障

2、系统的有效性 压差、风速、微粒、照度 （外包服务合同）2、清洁、静态与动态监控、熏蒸3、环境菌库 酒精棉球分离微生物 新洁尔灭分离微生物 酸碱苯酚6环境菌库洁净环境常见菌（浮游菌）：头状葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）缓症链球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黄微球菌（Micrococcusluteus）一般使用的阳性对照：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003铜绿假单胞菌（Pseudomona

3、s aeruginosa）CMCC(B)10104生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)980037（二）、操作环境1、隔离器2、生物安全柜3、超净工作台8（二）、操作环境9（三）、关键设备 微生物检查薄膜过滤仪 一次性薄膜过滤培养器应急检验用一次性薄膜过滤培养器10（四）、对照培养基 培养基适用性（灵敏度）； 培养基性能稳定性（标准化）。对照培养基理化

4、评价（可控性）生物学评价（有效性）回收率比较MPN比较生长曲线比较生态评价某些CRS原则固态培养基液态培养基琼脂加减法11二、检验程序环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断12二、检验程序接受任务实验方案实验准备样品核对实验操作过程监控培养观察有效的结果物 质 保 障13（一）、实验准备实验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无患，应随时保证“来之能战” 。尤其注意常备有效期要求的物品：培养基、冲洗液、滤器、小型实验器材等。14实验准备无菌室专用酒精棉球制备实验准备场地清洁实验准备台面清洁15（二）、样品核对尽快取得样品，确保样品传递过程

5、中的完整性、安全性、有效性；仔细核对样品及样品资料，高度关注媒体公布样品（问题样品），同时尽量获取非问题样品及同类样品，进行比较实验、比较分析；样品外观检查、完整性检查。16样品外观检查欣弗样品外观检查刺五加样品外观检查双黄连样品完整性真空检漏17（三）、实验操作不断完善标准化操作规程（SOP），严格避免实验室污染。实验人员 培养基实验器材实验环境检验结果待检样品原料 辅料 设备环境药品（食品）人员 药品食品生产过程中可能污染微生物的主要环节药品食品微生物检查过程中可能污染微生物的主要环节18三、结果判断长菌与否分离鉴定溯源调查结果报告可靠的结论有效的结果物 质 保 障19三、结果判断 是不是

6、微生物？ 是什么微生物？ 微生物来自哪里？ 几点思考 参见：FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌的相似性考 察药学学报，2007，42（11）：11891194 判断无菌检查阳性结果有效性的实验探讨药物分析杂志， 2008， 28（05）：6671 201、长菌与否？浑不浑浊?物理变化、化学变化还是生物变化？一靠经验二靠实验三靠严格程序控制避免干扰21是不是微生物？（1）、液体培养基浑浊 物理变化？化学变化？生物学变化？（2）、平板上的菌落 琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层 菌落or药渣？22菌落or药渣？经60Co射线大剂量照射再检验延长培养时间到7天重新划线培养镜检232、

7、分离鉴定（1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继续培养；（2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80保存；（3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，分离污染微生物；（4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。24是什么微生物？宏观：生长形态微观：镜检鉴定：生化鉴定（API、BD） 核酸鉴定（16sRNA、DNA） 253、溯源调查样品阳性培养物分离菌株检验过程监控菌株环境菌（近期、远期）现场调查收集菌株鉴定与相似性分析相结合传统方法与新技术相结合不同方法的交叉验证26微生物来自哪里？

8、相似性分析 同源性分析 脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR） 2728溯源性分析例1欣弗事件 头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcuscapitis ssp capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）缓症链球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcuscohnii sspcohnii）藤黄微球菌（Micrococcusluteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）。监测到的环境菌株29溯源性分析例2编号BD鉴定走廊1B.pumilus 走廊2M.lu

9、teus 走廊3/无菌室4C.urealyticum 无菌室5K.kristinae 无菌室6C.urealyticumC1524-FS.caprae C1524-BS.caprae C1525-B1-1S.warneri C1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidis C1526-F2S.haemolyticus菌株16sRN

10、A鉴定可信度C1524-FS. haemolyticus99%C1524-BS. haemolyticus98%C1526-F2S. haemolyticus100% 双黄连注射液 利巴韦林注射液 FTIR相似性分析 DuPont RiboPrinter基因指纹分析30几点思考（1）、怎样才算是同一株菌？ 需要深入认识微生物本身 微生物变异与保守的相对性； 分析方法的可变性与微生物本身的可变性；生物学先锋琳恩马古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果将一个特殊的质粒植入大肠杆菌，大肠杆菌便会突然间变成克雷伯氏杆菌”。 31几点思考（2）、什么是最适宜的技术？ 需要深入认识分析微生物的

11、技术和手段 形态学分析与相似性分析（生化反应谱、片段相似性、FTIR光谱相似性等），在权衡方法本身的边界和微生物变异性边界的基础上，似乎更适合对亲缘关系下一个否定的结论，即排除法，在这个意义上是否可以引入化学分析的3概念、精密度概念？ 324、几点思考（2）、什么是最适宜的技术？ 16sRNA cDNA序列，需要研究，太保守不利于区分；变异率太高（高到普通传代、培养难以控制）则没有意义。但一般来说16sRNA cDNA序列水平具有确定意义，困难在于确定足够长。 溯源分析不仅仅是鉴定到种，而是到株，对菌株的稳定性认识？与之相关的技术粗放性问题。 334、几点思考（3）、怎样下结论？ 分析的根本目的是要下一个结论 以检验活动为中心、以检验过程为线索、以实 验事实为依据，根据所有信息的综合分析能力。 对阳性检出菌的技