5种大黄蒽醌类衍生物的同时测定及应用

1、5种大黄蒽醌类衍生物的同时测定及应用【摘要】目的建立同时测定大黄药材中5种蒽醌类衍生物芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的方法，优化大黄蒽醌的超声提取工艺。方法采用反相高效液相法，色谱柱：aters18柱2504.6,5；流动相：甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液(352)；柱温：25；流速：1.0l/in；检测波长：225n。结果5种游离蒽醌均具有较宽的线性范围且呈良好的线性关系R2=0.99870.9997，平均回收率为92.79%99.28%，日内精细度为0.65%1.71%，日间精细度为2.52%3.46%。结论该方法成功应用于大黄活性物质的提取工艺优化，根据所建立的方法测

2、得的5种游离蒽醌含量，确定了大黄蒽醌的最正确超声提取工艺为：以70乙醇为溶剂、料液比为130(gl)、超声提取2次、每次提取20in。【关键词】超声提取；大黄；RP-HPL；蒽醌Abstrat：bjetiveTdevelpaethdfrthesiultaneusdeterinatinffiveanthraquinnederivatives(ale-edin,rhEin,edin,hrysphanlandphysin)inrhubarb,andtptiizetheultrasniextratinnditins.ethdsRP-HPLnaaters18lun(2504.6,5)asused.The

3、bilephaseasethanl-aetnitrile-0.01%phsphriaidslutin(3:5:2),ataflratef1.0l/in,andthedetetinavelengthas225n.ResultsThelinearrangesfthefivefreeanthraquinnesereide,shinggdlinearrrelatinsithrrelatineffiients(R2)f0.9987t0.9997.Theaveragereverieserefr92.79%t99.28%.hiletheintra-dayandinter-daypreisinere0.65%

4、1.71%and2.52%3.46%,respetively.nlusinThrughthententsffiveanthraquinnederivativesbtainedbythedevelpedRP-HPLethd,theptiuultrasniextratinnditinsaredeterinedasflls:using70%EtHasextratingslvent,thesapleisextratedttiesandeahtiefr20inbyaultrasnipressr,hentheslidtliquidratiis1:30(g/l).Keyrds：Ultrasniextrati

5、n;Rhubarb;RP-HPL;Anthraquinnes大黄RadixetRhizaRhEI为蓼科植物掌叶大黄RheuPalatuL.，唐古特大黄Rheutangutiuaxi.exBalf或药用大黄RheuffiinaleBaill的枯燥根和根茎，味苦、性寒。临床研究证实，大黄具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤和抗炎、泻下作用及抗菌性、止血性等多种生物学活性1。其主要有效成分为蒽醌类衍生物,包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚以及与葡萄糖结合成苷。5种蒽醌是大黄以及衍生中药大黄属2质量控制的基矗大黄中蒽醌的别离和测定方法有薄层色谱法(TL)3，高速逆流色谱法(HS)4，5，胶束电动

6、毛细管色谱法(EK)6，毛细管区带电泳法(ZE)7，高效液相色谱法(HPL)8，加压毛细管电色谱(pE)9。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最普遍和常用的分析方法。本文建立了同时测定大黄药材中5种蒽醌衍生物芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的RP-HPL法，旨在确定大黄蒽醌的最正确超声提取工艺，同时可应用于大黄药材及其制剂质量的定量评价，为大黄药材的有效开发和利用提供根据。1仪器与材料Agilent1100型高效液相色谱仪四元梯度泵，DAD检测器，HPheStatin色谱工作站，美国安捷伦科技，上海BRANSNSB2200超声波发生器，D1810型电子分

7、析天平上海申生科技，R-201型旋转蒸发器上海申生科技，万能粉碎机(天津泰斯特仪器)。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品购自中国药品生物制品检定所；四川产大黄药材购于湖南国杏中药饮片有限责任公司，经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定为正品。药材于40枯燥、粉碎过40目筛，贮于枯燥器中置暗处保存备用；甲醇、乙腈、磷酸均为江苏汉邦科技消费的色谱纯，二次蒸馏水，乙醇、醋酸乙酯、石油醚、正己烷等均为北京化工厂消费的分析纯试剂。2方法与结果2.1HPL-DAD分析条件色谱柱为atersPAH18色谱柱4.6250,5；柱温：25；进样量：20l；流速：1.0l/in；检测波长225

8、n。流动相为甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液(352)。试样过0.45的微孔滤膜后进展HPL分析。2.2标准溶液的配制2.2.1标准储藏液精细称取5种对照品适量，加甲醇配制成含芦荟大黄素135g/l，大黄酸105g/l，大黄素90g/l，大黄酚90g/l，大黄素甲醚(75g/l)的标准混合储藏液。于4下冷藏，备用。2.2.2工作标准液临用前精细汲取适量加甲醇配制成每1l分别含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为13.5，10.5，9，9，7.5g的工作标准液。2.3样品溶液制备称取0.5g大黄细粉，用15l溶剂正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、

9、水进展超声提取,抽滤，滤液于40下真空旋转蒸发至干，后用甲醇溶解定容于10l容量瓶中，于4下冷藏，备用。2.4方法学实验2.4.1色谱别离在拟定的色谱条件下，得到芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的标准色谱图(图1a)以及大黄药材样品的色谱图(图1b)。由图1可知，样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚与相邻组分的别离度Rs1.5,到达基线别离。2.4.2线性关系取混合标准储藏液适量，用甲醇稀释成一系列不同浓度的标准溶液，分别进样3次，以标准溶液浓度X对峰面积Y进展线性回归，各组分在各自浓度范围内线性关系良好。结果见表1。表15种标准品线性范围，线性方程和回归系数略2

10、.4.3精细度考察精细度分为日内精细度和日间精细度。对同一工作标准液在日内连续进样5次，得日内精细度，结果测得峰面积的RSD为芦荟大黄素0.65%，大黄酸1.09%，大黄素0.98%，大黄酚1.39%，大黄素甲醚1.71%；在连续3d内分别测定5次得日间精细度，结果测得峰面积的RSD为芦荟大黄素3.46%，大黄酸2.52%，大黄素3.26%，大黄酚3.15%，大黄素甲醚3.06%。2.4.4重复性考察在上述色谱条件下，对同一批样品按样品溶液的制备方法平行制备6份，分别进样20l，进样测定，按外标法测定含量并计算RSD，芦荟大黄素2.52%，大黄酸2.20%，大黄素2.10%，大黄酚2.07%，

11、大黄素甲醚2.89%。转贴于论文联盟.ll.2.4.5准确性加样回收率实验取含量的大黄药材细粉适量，精细参加对照品适量，振摇，其余按样品溶液的制备方法，在上述一样色谱条件下分别进样，按外标法测定其含量,计算加样回收率和RSD。结果见表2。表2测定方法回收率结果略2.5方法的应用最适超声提取工艺确实定称取0.5g大黄细粉，用50l溶剂正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水进展超声提取30in,抽滤，滤液于40下真空旋转蒸发至干，后用甲醇溶解定容于10l容量瓶中，于4下冷藏，备用。在上述色谱条件下对各提取液进展HPL分析，测定其中5种游离蒽醌含量。结果见表3。

12、表3溶剂对游离蒽醌提取率的影响略表3结果说明，正己烷等低极性溶剂提取大黄游离蒽醌效率低，而甲醇，乙醇提取率高，在水中提取效率很低，且提不出大黄酸，这是因为其在水中溶解性校大黄游离蒽醌中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素在以80%甲醇作为提取溶剂时，提取率最高；大黄酚、大黄素甲醚在以甲醇作为提取溶剂时，提取率最高；游离蒽醌提取效率次高的为70%乙醇。考虑到甲醇有毒，不宜用于食品和药物的加工，而乙醇从自然得来，本钱低等诸因素，我们认为70%乙醇最适宜。以70%乙醇为提取溶剂，其他条件不变，考察不同超声提取时间10，20，30，40，60in对5种游离蒽醌提取率的影响：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素在20in

13、时提取率最高2.092，2.913，2.497g/g，大黄酚、大黄素甲醚在40in提取率最高5.069g/g、1.294g/g，在20in时次之5.042g/g，1.286g/g，综合考察选择20in为提取时间。以同样的方法，分别考察了不同料液比15，110，120，130，140，150g/l以及超声提取次数对提取效率的影响。结果显示，5种大黄游离蒽醌在130料液比时提取效率最高；超声提取两次最为适宜。3结论本文建立了同时测定大黄药材中5种蒽醌类衍生物芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的RP-HPL法，该方法测定5种游离蒽醌的日内和日间精细度RSD分别在0.65%1.71%和

14、2.52%3.46%之间，准确度高；回收率在92.79%99.28%之间；具有宽线性范围和良好的线性关系R2在0.99870.9997之间。所建立的方法应用于大黄活性物质的提取工艺优化，确定了大黄蒽醌的最正确超声提取工艺为：以70乙醇为溶剂、料液比为130(gl)、超声提取2次、每次提取20in。本实验为大黄的进一步研究和开发奠定了良好的基矗【参考文献】1H.HngraphsnSeletedediinalPlants.rldHealthrganizatin,Geneva,1999:231.2Kuhing-Hua,SunSha-en.Analysisfninerhubarbanthraquinn

15、esandbianthrnesbyiellareletrkinetihratgraphyusingexperientaldesignJ.AnalhiAta,2022,482:47.3SinghNarendraP,GuptaAjaiP,SinhaArunK,etal.High-perfranethinlayerhratgraphyethdfrquantitativedeterinatinffurajranthraquinnederivativesinRheuediJ.JhratgrA,2022,1077:202.4YangFuquan,ZhangTianyu,TianGuilian,etal.P

16、reparativeislatinandpurifiatinfhydrxyanthraquinnesfrRheuffiinaleBaillbyhigh-speedunter-urrenthratgraphyusingpH-dulatedstepiseelutinJ.JhratgrA,1999,858:103.5LiuRenin,LiAifeng,SunAiling.PreparativeislatinandpurifiatinfhydrxyanthraquinnesandinnaiaidfrthehineseediinalherbRheuffiinaleBaillbyhigh-speedunt

17、er-urrenthratgraphyJ.JhratgrA,2022,1052:217.6ShangXiayu,YuanZhubin.DeterinatinfsixpnentsinRhubarbbyyldextrin-difiediellareletrkinetihratgraphyusingaixediellarsystefsdiuhlateandsdiutaurhlateJ.AnalhiAta,2002,456:183.7DingJ,NingB,FuG,etal.SeparatinfrhubarbanthraquinnesbyapillaryeletrhratgraphyJ.hratgrapia,2000,52:285.8KyaaJunk,ritaIzui,KbayashiNrihir.Siultaneusdeterinatinfanthraq