高糖环境对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响及脑神康胶囊的干预

1、高糖环境对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响及脑神康胶囊的干预【关键词】海马神经元；高糖；凋亡；黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶；脑神康胶囊【Keyrds】Hippapalneurns;Highgluse;Apptsis;Xanthine/xanthinexidase;Nashenkangapsule高血糖可引起神经传导速率下降和神经纤维变性，其神经系统的损害除表如今周围神经和自主神经系统外，亦可累及中枢神经系统1，出现糖尿病脑功能损害2，这主要是由于高糖所引发的神经细胞的凋亡所致。目前已有较多文献报道了细胞凋亡与周围神经病变的亲密关系3，4，但少见细胞凋亡与脑功能损害的关系报道。本课题组前期研究了脑神康胶

2、囊对乏氧海马神经元凋亡蛋白表达的影响，结果提示糖尿病引起的海马神经元凋亡可能与乏氧有关4。本实验旨在观察高糖状态对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响，并研究脑神康胶囊的干预作用及其机制。1材料与方法1.1材料1.1.1动物成年雄性istar大鼠，出生24h之内的istar新生鼠均由山东大学实验动物中心提供，大鼠消费答应证号SXK鲁20220004。1.1.2药品及试剂脑神康胶囊由生黄芪、熟地、黄精、川芎、枸杞子、淫羊藿、苍术、野葛根、黄连等组成，由山东大学齐鲁医院制剂室提取制备，每克相当于生药3.564g，用蒸馏水配制成5%水溶液备用。盐酸川芎嗪注射液购自山东潍坊制药厂，批号：030618；胰蛋

3、白酶、多聚赖氨酸、葡萄糖、无水甘露醇、四甲基偶氮唑盐(TT)、黄嘌呤X和黄嘌呤氧化酶X、阿糖胞苷购自Siga；低糖型DE、DE/F12、高糖型DE培养基购自Hylne公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技开展；Trizl购自上海生工生物工程技术效劳；TaKaRa逆转录试剂盒和SYBRGreen购自大连宝生物工程；毛细管购自Rhe公司，所有引物均由上海Invitrgen公司合成。其余试剂为国产分析纯。1.2方法1.2.1含药血清的制备30只成年雄性istar大鼠随机分为5组，每组6只，第1、2、3组分别给予脑神康低5l/kg、中10l/kg、高浓度20l

4、/kg灌胃，第4组给予盐酸川芎嗪注射液40g/kg腹腔注射，第5组给予同等量生理盐水灌胃，以上操作均2次/d，连续3d。第3天末次给药1.5h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，无菌剖腹，下腔静脉取血，凝后3000r/in离心8in，别离血清，56灭活30in，分装，-20保存备用。1.2.2原代培养细胞出生24h之内的istar新生鼠，无菌条件下别离出双侧海马，剥除脑膜及结缔组织，剪为13的小块，置含有0.125%胰蛋白酶的PBS中，37消化15in，参加含10%胎牛血清的DE/F12培养液终止胰蛋白酶的作用，轻轻吹打，使组织分散成单细胞悬液，并经200目不锈钢筛过滤，以1106/L的密度接种于经

5、0.1g/L多聚赖氨酸处理过的6孔板中，置37、5%2的培养箱中培养，并于接种的第3天参加阿糖胞苷(终浓度为10g/L)作用24h以抑制胶质细胞的增殖。此后每3天半量换液。1.2.3氧化损伤模型制备取原代培养的大鼠海马神经元在高糖环境和非高糖环境下培养至第8天的神经细胞用于实验，随机分为以下8组：对照组5.5l/LDE培养液，高糖组25l/LDE培养液、X/X组、川芎嗪组、生理盐水组、脑神康低浓度组、脑神康中浓度组、脑神康高浓度组。对照组继续培养，X/X组：参加终浓度为1l/L的X和20U/L的X产氧体系，作用45in后换无血清高糖培养基培养，12h后测指标。高糖组：换无血清高糖培养基培养，1

6、2h后测指标。余5组分别将川芎嗪、生理盐水、脑神康低浓度、中浓度、高浓度提早参加培养基内作用30in，后参加X/X体系作用45in后换无血清高糖培养基培养，12h后测指标。转贴于论文联盟.ll.1.2.4TT法测定细胞代谢率将细胞以1105/孔接种于96孔板，每孔参加10lTT(终浓度为0.5g/L)，对照孔不作处理，4h后，终止培养，吸去上清，每孔参加100l二甲基亚砜，平行振荡10in，用酶标仪在490n处测定D值。神经元存活率=试验组D值/对照组D值100%。1.2.5流式Annexin/PI双染法测细胞凋亡率1.3统计学处理实验结果采用SPSS16.0软件分析，数据以xs表示，两组间计量资料的比拟采用t检验和方差分析。2结果2.1各组海马神经元存活率及凋亡率检测结果与对照组相比,高糖组及X/X组神经元存活率明显下降，凋亡率显著升高(均P0.01)；与高糖组相比，X/X组神经元存活率显著下降，凋亡率显著升高(P0.05)；与X/X组比拟，川芎嗪组及脑神康各浓度组神经元存活率上升，凋亡率明显下降。其中脑神康中浓