2022年伪狂犬病活疫苗

1、伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）生产工艺规程编制人 ：年 月 日审核人 ：年 月 日批准人 ：年 月 日目 录一、目 的：伪狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）生产工艺规程的方法和程序；二、适用范畴：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的生产的全过程三、依 据：伪狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）制造及检验试行规程四、责 任 者：生产车间、质管部；五、正 文： 工艺流程及质量掌握要点 操作细就1、制苗材料的制备2、生产用种毒的制备3、半成品的配制4、配苗5、疫苗的分装6、疫苗的冻干7、轧盖贴标8、包装 成品检验 工艺卫生与人员卫生 生产设备一览表 包装机检查

2、方法 物料平稳 劳动定员及劳动爱护吉林和元生物工程有限公司GMP治理文件题目伪狂犬病活疫苗 （Bartha-K61 株）生产编码：共 13 页工艺规程SOP-SC- - 制定审核批准制定日期审核日期批准日期颁发部门 办公室 颁发数量 生效日期分发单位 办公室、生产技术部、质管部一、目 的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的方法和程序；二、适用范畴：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）的生产的全过程三、依 据：伪狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）制造及检验试行规程四、责 任 者：生产车间、质管部；五、正 文：【品 名】伪狂犬病活疫苗（ Bartha-K61

3、株）【质量标准】本企业伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61 株）质量标准【外 观】本品为淡黄色海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后快速溶解；【规 格】10 头份/ 瓶、 20 头份 / 瓶、 70 头份/ 瓶【储 藏】在-15 以下,有效期暂定为 18 个月【作用与用途】用于高致病性猪繁衍与呼吸综合征；免疫期为 4 个月；【用法与用量】1 按瓶签注明的头份加生理盐水稀释,耳根后部肌肉注射；【成品代码 】2 仔猪断奶前免疫1 次,1 头份 / 头；3 母猪配种前免疫1 次,1 头份 / 头；C 【批量】40000 瓶I 工艺流程及质量掌握要点鸡胚成纤维细胞制及 接种种毒制旋转培收获不合半成品

4、检验配合苗 格无 害 化 处分装冻干轧盖贴标包合 格 入 成入待检成品检不合格入报废品销售无 害 化 处 理伪狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）质量掌握要点II 工序质量掌握要点质量掌握项目频次毒种制备种毒无菌检验每批病毒含量每批细胞制备消化时间、温度每批细胞外源病毒检验每批毒液制备接种接 种 量每批观察细胞再生状况每批无菌检验每批配苗半成品检验病毒含量每批半成品、爱护剂无菌检验每批配苗比例每批分装分装过程无菌检验分装过程中前、中、后检验分 装 量间隔半小时标定分装量冻干冻干曲线共融点、真空度每批成品检验成品理化指标每批无菌检验每批鉴别检验每批效力检验每批操作细就安全检验每批外源病毒检

5、验每批支原体检验每批本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收成感染病毒液,加相宜稳固剂,经冷冻干燥制成,用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病；1 制苗材料的制备1.1 条件预备1.1.1 依据细胞制备所需物品及设备条件,进行全面预备；1.1.2 按使用时间,提前做好灭菌工作后将预备好的各种物品提前移入干净工作间待用；1.1.3 在工作开头前 3040min,按净化级别要求调整送风量,达到干净级别要求；1.2 操作规章1.2.1 细胞的制备发育良好的 910 日龄 SPF鸡胚；挑选 910 日龄发育良好的 SPF鸡胚,先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位,无菌取出鸡胚,去头、四肢和内脏,放入灭菌的玻璃器皿

6、中,用汉克氏液洗涤胚体,用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块,再用汉克氏液洗涤23 次,然后加 0.25%胰酶溶液（每胚 4ml）,37.5 38.5 消化 2030 分钟,吸出胰酶溶液,用汉克氏液洗涤 23 次再加入适量的养分液（用含 5%10%犊牛血清乳汉液,加相宜的抗生素适量）吹打,用 46 层纱布过滤,制成每 1ml 含活细胞数约 100150 万的细胞悬液,分装于培育瓶中进行培育,形成单层后备用；细胞培育物应无细菌、霉菌（见无菌（纯粹）检验标准操作规程）和支原体（见支原体检验标准操作规程 ）污染,无特异性病变；将细胞冻融液接种 Marc-145 细胞,应不显现任何病变 （见外源病毒检测标准

7、操作规程 ）；1.3 清场和记录1.3.1 工作终止后,应全面清场,对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理；1.3.2 全面填写生产工序记录 ；2 生产用毒种的制备2.1 条件预备 2.1.1 依据毒种制备所需物料及设备条件,进行全面预备； 2.1.2 按使用时间,将预备好的各种物品提前移入干净工作间待用； 2.1.3 在工作开头前 3040min,按净化级别要求调整送风量,达到干净级别要求； 2.2 操作规章 2.2.1 制苗用病毒液的制备2.2.2.1 细胞单层培育 将扩大培育的种子细胞接种到转瓶中培育,掌握转速 912转/ 小时；接种 取所需数量的、细胞掩盖率达

8、到 80%以上的细胞转瓶,弃去生长液,按 2（V/V）接种病毒,加入含 2%胎牛血清的细胞培育液, 37 C 旋转（ 912转/ 小时）培育；收成在显微镜下观看由病毒引起的细胞病变（CPE）,直至 CPE达到 70%以上收成细胞培育物,反复冻融 1 次,经离心或过滤除去细胞碎片,冻存于 2.2.2 毒种鉴定 毒标准- 40 C 以下；2.2.2.2病毒含量将毒种用无血清培育基做10 倍系列稀释,取 10-4、10-5、10-6、10-74 个稀释度,分别接种于 96 孔细胞板, 每个稀释度接种6 孔,每孔 0.1mL,设置正常的细胞对找孔,放置 5%CO 2,37下培育观看 35日,依据 Re

9、ed-Muench法运算 TCID50；病毒含量应 10 7.0TCID50；2.2.2.3 鉴别检验中和试验： 将毒种用无血清培育基稀释成10 3TCID50/mL,取 0.1mL与等量呼吸综合征病毒特异性阳性血清混合,同时设病毒对比组和正常细胞对比组,37作用 1 小时后,接种Marc-145 细胞培育板,观看 5 日；应不产生细胞病变（ CPE）；1.2.2.2 病毒基因鉴定 应用以下引物进行 RT-PCR检测,毒种可扩增出 581bp的特异性条带,以而猪繁衍与呼吸综合征病毒 NVDC-JXA1-R株为代表的高致病性猪繁衍与呼吸综合征病毒以及其他猪繁衍与呼吸综合征病毒核酸为阴性（猪繁衍与

10、呼吸综合征病毒 JXA1-R 株 RT-PCR检测方法见附注 3）；U1 ATTTGAATGTTCGCACGGTCTC D2 CGGAACCATCAAGCACAACTCT 毒力对仔猪的毒力 用 JXA1-R-R 株毒种（ 10 6.0TCID50/mL）接种 46 周龄抗原猪繁衍与呼吸综合征病毒、抗体阴性仔猪（阴性猪标准见附注 1）5 头,每头颈部肌肉注射 2mL,同时设 5 头阴性猪作对比,隔离饲养；接种猪逐日测量体温,观看临床症状,均不发病（发病猪判定标准见附注 2）；对妊娠母猪的毒力 用 JXA1-R-R株毒种（ 10 6.0TCID50/mL）接种怀孕 8090 天的母猪3 头,每头颈

11、部肌肉注射 2mL,同时设同期怀孕母猪 3 头做对比,隔离饲养,观看母猪临床症状和分娩产仔状况；怀孕母猪应不发生流产,所产仔猪的存活率与未接种对比组无统计学差异；免疫原性 取 46 周龄猪繁衍与呼吸综合征病毒抗原、抗体阴性猪（阴性猪标准见附注 1）10 头,其中 5 头肌肉注射 JXA1-R-R 株毒种 2mL（10 5.0TCID50/mL）,另 5 头作为对比,同条件下隔离饲养； 28 日后,全部猪肌肉注射检验用强毒NVDC -JXA1株病毒培育液（病毒含量10 4.5TCID50/mL）3mL,每天测温并观看21 日；对比猪均应发病,且至少2 头死亡,免疫猪应至少 4 头爱护（发病猪判定

12、标准见附注） ；2.2.2.6 纯洁 按现行中国兽药典进行检验,应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染；2.2.3 基础种子代数 8290 代；2.2.4 种毒储存 -70下,储存期暂定为 12 个月；2.2.5 强毒标准病毒含量将毒种用无血清培育基做10 倍系列稀释,取10-3、10-4、10-5、10-64 个稀释度,分别接种于 96 孔细胞板,每个稀释度接种6 孔,每孔 0.1mL,在 37下培育观看 57日,根据 Reed-Muench法运算 TCID50；病毒含量应 10 5.5TCID50/mL；对猪的毒力 取 810 周龄的猪繁衍与呼吸综合征病毒抗原抗体阴性猪（阴性猪标准见附注1）

13、5 头,每头猪肌肉注射检验用强毒NVDC-JXA1-R（10 4.55.0 TCID50/mL）3mL,每天测温并观看21 日；猪均应发病,且至少 2 头死亡；1.3.3 毒种代次 5 6 代；2.2.6 毒种储存在- 70以下,储存期暂定为12 个月；3 细胞系病毒培育用细胞为 Marc-145,由中国动物疫病预防掌握中心鉴定、保管和供应；3.1 细胞标准3.1.1 细胞形状用含 8犊牛血清的 DMEM细胞培育液,37、5CO 2培育 2h 即可贴壁,24h内可长成单层；显微镜下,细胞呈三角形、多角形、圆形等多种形状；3.1.2 外源病毒检验3 取 2 个细胞单层,每个单层至少6cm 2,培

14、育 7 天,每日观看细胞,应无细胞病变；3.1.2.2 血吸附病毒检验 按现行中国兽药典进行检验,应无红细胞吸附现象；3.1.2.3 其它特定病毒的检验 采纳 PCR或 RT-PCR方法检测,应无 BVDV、PCV、CSFV、PPV、PRV和 JEV污染；3.1.3 胞核学检查对不同传代水平的细胞,取50 个处于有丝分裂中期的细胞进行检查；在基础细胞库细胞中存在的染色体标志,在最高代次细胞中也应存在；与基础细胞库的细胞相比,全部细胞的染色体模式数不得高出15%；核型必需相同；3.1.4 致瘤性检验用无胸腺小鼠至少10 只,各皮下或肌肉注射10 7个待检细胞,同时用 Hela细胞皮下或肌肉注射无

15、胸腺小鼠,每只10 6 个细胞,作为阳性对比,用鸡胚成纤维细胞作为阴性对比；观看 21 日, Marc-145 细胞应无肿瘤形成,阳性对比组应显现明显的肿瘤,阴性对比组应为阴性；3.1.5 无菌检验 按现行中国兽药典进行检验,应无菌生长；3.1.6 支原体检验 按现行中国兽药典进行检验,应无支原体生长；3.2 细胞代次 基础细胞应为 110 代,工作细胞代次应为 1025代,生产用细胞应在 40 代以内；3.3 储存液氮储存；储存期36 个月；4 疫苗制造及半成品检验4.1 生产用毒种制备4.1.1 毒种繁衍 将已长成单层的 Marc-145 细胞倒去生长液,换以含 2毒种的细胞维护液,置 3

16、7下培育 23 天,当 70以上细胞显现病变时收成,置 然后进行鉴定；- 40冻融 1 次,离心后分装,45 项进行,应符合规定；符合上述标准的毒种作为生产用毒种；4.1.3 毒种储存在- 70下储存,应不超过12 个月；4.1.4 毒种继代应不超过 3 代；4.2 清场和记录4.2.1 工作终止后,应全面清场,对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理；4.2.2 全面填写生产记录 ；5 半成品的制备5.1 条件预备5.1.1 依据毒液繁衍所需物料及设备条件,进行全面预备；5.1.2 按使用时间,将预备好的各种物品提前移入干净工作间待用；5.1.3 在工作开头前 304

17、0min,按净化级别要求调整送风量,达到干净级别要求；5.2 操作规章5.2.1 接种 取所需数量的、细胞掩盖率达到 80%以上的细胞转瓶,弃去生长液,按 2（V/V）接种病毒,加入含 2%胎牛血清的细胞培育液, 37 C 旋转（ 912转/ 小时）培育；5.2.2 收成 在显微镜下观看由病毒引起的细胞病变（CPE）,直至 CPE达到 70%以上收成细胞培育物,反复冻融 1 次,经离心或过滤除去细胞碎片,冻存于- 40 C 以下；5.3 半成品检验5.3.1 检验,病毒含量应 10 7.0TCID50/mL；5.3.2 无菌检验 按现行中国兽药典进行检验,应无菌生长；5.4 清场和记录5.4.

18、1 工作终止后,应全面清场,对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理；5.4.2 全面填写生产记录 ；6 配苗6.1 条件预备6.1.1 依据配苗所需物料及设备条件,进行全面预备；6.1.2 按使用时间,将预备好的各种物品提前移入干净工作间待用；6.1.3 在工作开头前 3040min,按净化级别要求调整送风量,达到干净级别要求；6.1.4 将检验合格的半成品于配苗前取出,融解待用；6.2 操作规章6.2.1 配制将经检验合格的病毒液按比例添加蔗糖脱脂乳冻干爱护剂,充分混合匀称；6.3 清场和记录6.3.1 工作终止后,应全面清场,对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废

19、弃物等应按规定分别进行处理；6.3.2 全面填写生产记录 ；7 疫苗的分装操作内容见分装岗位标准操作规程 ；8 疫苗的冻干操作内容见冻干标准操作规程 ；7 轧盖、贴标操作内容见轧盖标准操作规程 、贴标标准操作规程 ；8 包装操作内容见包装标准操作规程III 成品检验见伪狂犬病活疫苗（ Bartha-K61 株）制造及检验试行规程、工艺卫生与人员卫生1 定期对干净室进行消毒,并依据沉降菌测定结果打算消毒周期；2 操作间的卫生按各自区域的清洁消毒规程进行；3 生产设备按各自清洁规程进行清洁消毒；4 原辅料进入生产区按规定程序进行清洁消毒；5 人员进入干净区时,必需按规定进行人净；进入干净区程序：更

20、鞋脱外 衣穿一般工作服更鞋脱一般工作服洗手穿干净服手消毒进入十万 级干净区更鞋手消毒套干净服手消毒进入万级干净区；6 人员在生产区内按区域个人卫生要求进行治理；万级区工 7 一般区工作服每三天清洗一次,十万级区工作服每天清洗一次,作服每班清洗一次, 万级干净区使用的工作服在清洗后进行灭菌,活毒操作区的工 作服须经灭菌后才能进行清洗；8 干净室温度掌握在 1826,相对湿度掌握在 30-65%；干净区与非干净 5 帕；区的静压差应 10 帕；不同级别的相邻干净区间压差应9 每批生产完毕,都应按清场治理规程进行清场； 更换产品应进行完全清场；、生产设备一览表主要生产设备及生产才能一览表编号设 备 名 称