实时荧光定量PCR

1、实时荧光定量PCR聚合酶链反应( PCR) 技术自1985年问世以来，以其灵敏性高、特异性强和速度快在分子生物学等科研领域得到了广泛应用。但是，由于传统的PCR 技术不能准确定量，在操作过程中易受污染而使假阳性率偏高; 因此，使其应用受到限制。实时荧光定量PCR技术拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，已成为了分子生物学研究的重要工具，Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time

2、qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。一、实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR 中，对整个PCR反应扩增过程进行实时监测和连续分析荧光信号，随着反应时间的延续，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，在PC

3、R 反应处于指数期的某一点检测PCR产物的量，并由此可以推断模板最初的含量。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数，荧光定量PCR采用参数“Ct”值，Ct值(cyclethreshold) 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可以绘制出标准曲线；因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上推算出该样品的起始拷贝数。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软

4、件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。二、Real-time qPCR基本步骤及实验设计 （一）实验材料的处理和准备以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组（CON）和处理

5、组（TRT）。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。 （二）引物设计 一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：扩增产物长度在80150bp。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。产物长度一般在1530碱基之间。G+C含量在40%60%之间。碱基要随机分布。引物自身不能有连续4

6、个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物5端可以修饰。引物3端不可修饰。引物3端要避开密码子的第3位。 （三）RNA提取和反转录在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则： = 1 * GB3 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 = 2 * GB3 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA

7、酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品可能富含RNA酶。 = 3 * GB3 在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。当然，这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA的提取。（三）Mix配制一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵

8、敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1l或者1l的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意： = 1 * GB3 MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。 = 2 * GB3 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最

9、好能在冰上操作。 = 3 * GB3 每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一个枪头加样。 = 4 * GB3 所有成分加完后，离心去除气泡。 = 5 * GB3 每个样品至少3个平行孔。 通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBRGreen等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。（四）仪器设置所有仪器的操作都基本一致

10、。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以ABI StepOne为例，详细看一下反应设置： A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。 B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法，Fast程序，以cDNA为模板进行。C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。 D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。 E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备。F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的

11、MasterMix。比如BioTeke的95 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是9515秒，6015秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。 G. 反应体系的设置： A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。设置好之后，就可以把配置好的

12、PCR管放进仪器，点击RUN。 三、实时荧光定量PCR的定量方法实时荧光定量PCR的定量方法有2种，即绝对定量法和相对定量法。绝对定量法是用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量法是在一定样品中靶序列相对于另一参照序列量的变化，由于每个模板Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始DNA 浓度的标准品即可绘制出标准曲线。（一）绝对定量法绝对定量法指的是用已知的标准曲线来推算未知样本的量，此方法要预先知道标准品的浓度。将标准品稀释成不同浓度并作为模板进行PCR反应，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标绘制出标准曲线。对未知样品进行定量时根据未知样品的Ct值

13、，即可从标准曲线中推出样品的起始拷贝数。（二）相对定量法比较标准曲线的相对定量法相对定量法指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本量的变化。由于该方法中量的表达是相对于某个参照物而言的；因此，相对定量法的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中，待测样本靶序列的量来自标准曲线，最后必须除以参照物的量，其他的样本为参照物量的n倍。在试验中为了准确加入反应体系的RNA或DNA，通常在反应中扩增1个内源管家基因作为参照基因，由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用来作为标准，比较来源不同的样本目的基因表达量的差异。管理基因是用于比较目的基因拷贝数，根据内参照补偿

14、待测样本核酸抽提过程中造成的目的基因损失，反应体系内是否存在扩增抑制因素及参照物标准化等。比较Ct值的相对定量法该方法是同时扩增待测靶基因片段和内参照基因片段。这2个扩增反应可以在2个反应管中分别进行，也可以在同1个反应管中进行，测得两者的Ct值之差即Ct。该方法不需要标准曲线，与标准曲线法不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加1倍的产物，以PCR反应的指数期得到Ct值来估算起始模板的量，一个循环(Ct=1)相当于起始模板数的2倍。此方法节省试剂，操作简便，但由于是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移会影响对实际拷贝数的估计；因此，如何优化反应体

15、系，使得目的基因和内参基因的扩增效率相等是该方法的难点。荧光定量PCR扩增曲线四、影响PCR及荧光PCR的其他因素引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要。可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。但是，好的设计并不等于好的实验结果，影响PCR和荧光PCR的因素非常多，下面择其重要进行介绍。（一）引物退火温度 引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温

16、度一般设定比引物的Tm低5。设定Tm有几种公式。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻分析法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5作为起始的退火温度，以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先

17、进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。（二）引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则计算引物浓度。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数（OD/mol）和消光系数的倒数（mol/OD）。 一

18、般商业合成的引物以OD值表示量的多少，在一般情况下，20个碱基长的引物，1个OD加100l水后引物浓度为50pmol/l（50M）。也可以用 OLIGO软件，根据引物的的消光系数（OD/mol），计算出一定的工作浓度下，引物的加水量。浓度(M)A260（OD/ml）稀释系数消光系数的倒数（nmol/OD） 举例：计算某寡HYPERLINK /yp/product-list-674.html核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10l稀释100倍（加入990l）水中。在A260处测吸光度为0.2。计算消光系数的倒数为4.8nmol/OD，代入得：浓度0.2（OD/ml）1004.8（nmol/OD）

19、96nmol/ml96M（三）引物、探针的纯度和稳定性 定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3到5合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。 引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100M。也可以用双蒸水溶解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于10M浓度溶于TE的

20、引物在-20可以稳定保存6个月，但在室温（15到30）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20保存至少1年，在室温（15到30）最多可以保存2个月。 探针即寡HYPERLINK /yp/product-list-674.html核苷酸进行荧光基团的标记，标记本身有效率的区别。探针标记以后一般应该纯化，纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高，且保存时间可以高达一年以上。不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2M（10），作为工作浓度分装多支，避光保存。（四）热启动 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的

21、方法之一。尽管Taq DNA HYPERLINK /yp/product-list-473.html 聚合酶的最佳延伸温度在72，HYPERLINK /yp/product-list-473.html聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的HYPERLINK /y

22、p/product-list-127.htmlPCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到HYPERLINK /yp/product-list-127.htmlPCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量

23、应用。（五）镁离子浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200MdNTP的实时HYPERLINK /yp/product-list-128.html定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液（普通PCR是1.5mM）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通PCR从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。（六）模板质量模板的质量会影响产量。DNA样

24、品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如HYPERLINK /yp/product-list-703.htmlSDS，在浓度低至0.01时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍HYPERLINK /yp/product-list-708.html去垢剂裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA。应注意进行PCR反应的模板质量，以增加PCR反应的成功率。（七）模板浓度 起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数PCR扩增和荧光 PCR扩增，104到106个起始目的分子

25、就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng到1g的人类基因组DNA，相当于3104到3105个分子，足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA 比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。对于一般的检测样品，10100ng的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释，对于HYPERLINK /yp/product-list-128.html定量PCR 而言是非常容易，且能分析扩增效率。（八）防止残余（Carry-over）污染PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块

26、被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源（非残余污染）。可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用带滤芯的HYPERLINK /yp/product-list-918.html移液管可以阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG

27、）移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。五、Real-time qPCR数据分析（一）Real-time qPCR常见参数 基线（baseline）通常是315个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。阈值（threshold）：自动设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈

28、值。 Ct值：与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候一般取Ct：1535。太大或者太小都会导致定量的不准确。 Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。 Rn：Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（Rn=Rn-基线）。 （二）影响Ct值的关键因素 模板浓度：模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在1535之间。反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响-比如溶液的pH值和盐浓度。 PCR反应的效率：PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条

29、件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90110%之间都是可以接受的。 （三）如何评估实时定量PCR反应的效果 PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。 R2值：另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）来准确预测X值（量）。如果R2等于0，你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99时，两个数值之间相关的可信度很好。 精确度：标准偏差（standar

30、d deviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。实际上，足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明，独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果PCR反应效率是 100%，那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大，分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于0.250。 灵敏度：无论CT绝对值是多少，任何

31、能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都达到了灵敏度的极限。PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。相反，它会遵循泊松分布，即进行大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约37%不含有拷贝，仅有约37%含有1个拷贝，约18%实际上含有两个拷贝。因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克服泊松分布的限制。六、实时荧光定量PCR 的应用实时荧光定量PCR 的应用范围很广，目前主要用于肿瘤的诊断、细胞因子表达的分析、病原体的分子检测、基因工程的研究等方面。（一）肿瘤的

32、诊断肿瘤基因遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现。实时荧光定量PCR技术不但能够有效地检测基因的突变，而且还能准确地测定表达量，进行肿瘤的早期诊断和治疗效果及预后的判断。该技术的应用已成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。曹恒斌等应用实时荧光定量PCR 方法成功证实肌细胞增强因子2与肝癌之间有密切关系。陈公琰等利用实时荧光定量PCR法检测hTERT mRNA 表达，证实端粒酶参与了人肺腺癌Anip973 /NVB 细胞的MDR，可将端粒酶作为逆转耐药的新靶点。（二）细胞因子的表达分析细胞因子在体内作为一种调节蛋白，其表达和分泌都受到严格的调控。在某些病理情况下，细胞因子的表达会出现异常，通过实时荧光定量PCR 技术可以对细胞因子的mRNA进行定量，来估算其蛋白表达量，从而可以对某些疾病进行诊断和研究。另外，细胞因子通过调节免疫反应在机体的免疫系统中起着核心作用。为了阐明在许多炎症反应、自身免疫性疾病、器官移植