分析仪器、试剂分析师认证讲座（3）小川 善資

1、生物試料分析Vol. 35, No 3 (2012)資料：分析機器試薬認定講座（）正確度検証法（）分析反応理論一致、反応曲線予測小川 善資. 検量 線予想（）2. 酵素活酵素活性測定、次式成立。Abs/min性測定法TVSVU/l 106式式国際単位規定毎分mol基質変化酵素活性U/l。由来、酵素活性共通。例題挙説明。（例）乳酸（LD)活性JSCC法測定。100、200、300、400U/l標準液用場合検量線予測。JSCCNADH（6.310 lmol-1cm-1）生成速度測定、酵素活性。、3量0.2 ml、試薬量2.8 ml。、100 U/l標準液測定時反応速度（Abs/min）次様予測。A

2、bs/min3.0100 U/L 1066.3 1030.2Abs/min 0.042/min同様、200、300、400 U/lAbs/min0.084、0.126、0.168計算作図図。検量線図LD活性測定検量線北里大学医療衛生学部臨床化学研究室252-0373 神奈川県相模原市南区北里1-15-1 256 生物試料分析3. 検量線推定、正確度X-R管理図法試薬異常分析機器問題発見当認定講座説明。問題X-R管理図法限、相対分析法測定血清血清測定値用全精度管理法当考方。累和法双値法用、少試薬分析機器異常見出。方法管理試薬分析装置異常早期検出。一方法使用標準物質発色吸光度。酵素活性測定、物質濃

3、度測定、検量線予測、用標準液標準血清表示値、吸光度分間変化吸光度変化量予測、予測数？値下。確実試薬分析機器問題点出。、時、測定必行。水測定大切、試薬精製水置換標準液測定吸光度。具体的試薬分析機器少異常見出、原因追及、対応策立新精度管理法反応曲線推定法後記述思。期待下。測定良思. 反応曲線予測分析何問題場合、反応曲線見。反応曲線何解。論理的説明、具体的様反応曲線変化勉強下。漠然見、少試薬問題、分析機器問題見思。1. 法物質定量場合分析誤差発生単純、簡単過、求、正測定導。LD用酸定量例取上、段階酵素反応、演算簡単、考、簡単、正分析行難、反応曲線予測本当難検査項目。問題LD活性測定同様。難最後示、確

4、認実験場合血清用、水溶性酸溶液、酵素溶液用推奨。、LD希釈充分注意下。単純冷却緩衝液希釈活性約半分。希釈後LD活性測定、勧。原理、単純操作測定法良。言方、LD希釈法項最後記述。種類酵素用定量時反応曲線予測。具体的LD用酸定量法考。（例）LD用酸定量LD用、NADH減少量340 nm測定、酸定量行反応曲線予測。測定操作法下記示操作法。、NADH吸光係数6.310cm-1。、LD酸対Km値1.010-4mol/l、酸分子量88。、反応一次反応速度従。3lmol-1 257 生物試料分析Vol. 35, No 3 (2012)測定操作法次様。表酸定量測定操作法容量終濃度100 mmol/l THCl

5、 Buffer (pH7.6)2.62 ml100 mmol/l0.16 mmol/l1.0 mmol/l0.1 U/ml2.4 mmol/l NADH50 mmol/l EDTA5 U/ml LD0.2 ml0.06 ml0.06 mlPreincubation at 37 for 10 min0.06 ml試料Incubation at 37 and determination of Abs at 340 nm反応予測1) 反応開始時吸光度反応開始時吸光度次様計算。0.23.02.4 6.3 1.0082) 中酸1.0 mmol/l存在様反応酸終濃度（A ）0求。0.063.01.0 0.

6、02 mmol/l変化量求。吸光度0.02 6.3 0.1263) 0.5分後吸光度変化量求。一次速度定数求。Vmax 0.1 1.0 min1Km 0.10.5分後生成物濃度（B ）計算。B0.5 A0(1e-kt) 0.02 (1e-1.00.5)7.9210-3生成物濃度吸光係数乗、減少分吸光度計算次様求。反応開始時吸光度0.5。従、0.5分後吸光度B 6.3 = 0.95040.5。同様、各時間毎吸光度演算、化、反応曲線推定（図）。図LD用酸定量時反応曲線 258 生物試料分析4) 式用近似値計算酵素反応一次速度条件従演算。、物質定量反応場合、反応開始反応終了、一次反応速度継続考難。、

7、反応開始時濃度高場合、低場合。高場合、一次速度速速度進行、上記演算求時間早反応終了。大程度時間反応終了計算場合上記演算充分、反応正確性議論場合不向。演算掲示使用推奨。方法5) 実験問題点取正測定場合、検体、試薬、標準液、管理試料種試料測定当然。酸定量、検体中存在LD反応物質、若干正誤差（酸定量実施直気思、反応直終了、反応部分。明酸反応、何LD反応物質反応思）。、検体取、差引。、検体取。理由定量反応必要 試薬種、LD、酸、NADH。、LD酸種正常検体存在。、NADH抜取、NADH抜反応起、検体取。問題LD活性測定同様問題発生、厳密正測定。LD希釈LD緩衝液希釈当然。、単純性簡単1/2程度低下。通

8、常酵素-OH基複数存在物質保護。具体的、糖糖類加失活難考。液粘性高、泡立嫌傾向。、液体表面薄膜形成性質（豆乳表面湯葉形成同原理。、性質、液泡立取扱。言）。酵素膜変形活性、少、添加。我実験酵冷却緩衝液希釈活素扱際、測定緩衝液10 mg/dl10添加溶液希釈。2. 種類酵素用（HK)-6-酸（G6PD)種類酵素用濃度測定時反応曲線推定。（例）HKG6PD用定量HKG6PD用、NADH増加量測定、定量反応反応曲線推定。測定操作法下記示操作法。、NADH吸光係数6.310、G6PDG6P対Km値6.310-5mol/l、分子量180。、反応一次反応速度従、360 mg/dl溶液測定反応推定。、試薬、試

9、料340 nm吸光度持物質演算。測定操作次表。3lmol-1cm-1。、HK対Km値1.010-4mol/l 259 生物試料分析Vol. 35, No 3 (2012)1) 反応開始時吸光度試薬、試料中340 nm吸光度持物質、反応開始時吸光度。2) 検体中濃度吸光度計算。360 mg/dl数変換。360 mg/dl3,600 mg/l3,600 mg/l180 20 mmol/l検体/総反応液量（6/3,000）吸光係数、吸光度差、206/3,0006.30.252。表HK法定量測定操作法試薬容量2.494 ml0.1 ml0.1 ml0.1 ml0.1 ml0.1 ml 終濃度100 m

10、mol/l Triethanolamine Buffer (pH8.2)60 mmol/l NAD100 mmol/l2.0 mmol/l60 mmol/l ATP2.0 mmol/l120 mmol/l MgCl24.0 mmol/l22.41 U/ml HK747 U/L287 U/L8.61 U/ml G6PDPreincubation at 37 for 10 min試料6 lIncubation at 37 and determination of Abs at 340 nm3) 反応開始1.0分後吸光度次様演算。段階酵素反応解析少難解演算式。反応共一次速度従最終生成物C次式求。A0

11、C k2（1ek1t）k1（1ek2t）式k2 k1式実数代入演算吸光係数乗吸光度求。具体的分後吸光度求。、k 、k 、A 求。各時間生成物濃度計算、120A020 6/3,000 0.04 mmol/lk （HK一次速度定数） 0.747/0.1 7.47定数） 0.287/0.063 4.561k （G6PD一次速度21.0分後吸光度0.04C1.0 4.56 （1e7.47） 7.47 （1e4.56） 6.3 0.2454.56 7.47。同様、各反応時間吸光度計算反応曲線求下。図HK法定量反応曲線（360 mg/dl試料、総反応液量3.0 ml、 6l、747 U/L HK、287 U/L G6PD添加時反応曲線） 260 生物試料分析測定使用酵素（HKG6PD）大過剰添加、酵素混在共雑酵素影響受、測定特異、必要 不可欠添加量適切添加。両酵素適切活性比知、生成物C生成速度k , k 関係調。反応速度最早時求、生成物C性失、干渉反応引起可能性。12生成式回微分、回微分値0点（変曲点）至時間（間tmax）求。次式。ln k1/k2tmax 式k1k2式明k /k 関係k 極端増加、k 増加反応終1212了時間短縮分。4) 反応曲線推定HKG6PD活、簡単反応曲線予測。一酵素失活場合、反応曲線状図示。具体的HK543 U/l、G6PD308 U/l場合反応曲線。結論