人表皮生长因子hEGF在大肠杆菌中的高效表达工艺研究医学毕业论文

1、第 页 共 23 页第 页 共 23 页人表皮生长因子 hEGF 在大肠杆菌中的高效表达工艺研究王文杰广州大学生命科学学院摘要 目的：为了提高hEGF （human epidermal growth factor）的产量，本次实验主 要从培养基优化，IPTG诱导浓度和诱导时间的摸索等方面来提高重组大肠杆菌hEGF表达量， 并进行了 5 L 发酵罐的小试发酵研究。 方法：采用摇瓶培养方式，先通过单 因子实验从甘油，乳糖，葡萄糖三种碳源中选出两种效果显著的碳源作为混合碳源。 从玉米浆，蛋白胨，酵母膏三种氮源中选出两种效果显著的碳源作为混合氮源。通 过“四因素三水平 ”正交实验确定最佳的培养基配方。

2、并在此优化的培养基基础上进 行 IPTG 浓度和诱导时间摸索。 结果：单因子实验确定了乳糖和甘油作为有效的混合 碳源，蛋白胨和酵母膏作为有效混合氮源， “四因素三水平 ”正交实验确定最佳的培 养基配方（甘油 1.5%，乳糖 2%，蛋白胨 0.5%，酵母膏 1.5%，氯化纳 1%）时表达 量达到14.8 %。同时，最佳的IPTG浓度为1.0 g/ml和最佳诱导时间为4h。5 L发 酵罐的小试发酵放罐时菌重（湿重）为 42.3 g/L,表达量为15.7 %。关键词 人表皮生长因子（hEGF）;大肠杆菌表达系统；培养基优化；发酵High-level expression of recombinati

3、on human EGF in E. coliWang wen jieSchool of Life Sciences， Guangzhou UniversityABSTRACT Objective: In order to improve the yield of hEGF, which was expessed in recombinant Escherichia coli. Studies include optimization of culture medium, searching for optimization concentration of IPTG and inductio

4、n time, were carried out. Also, a small-scale fermentation was carried out in 5 L fermentor. Methods: To study the optimal cultivation condition, single factor and orthogonal experiment had been combined to research by shake-flask cultivate. Two kinds of carbon source and nitrogen source was selecte

5、d from lactose, glycerol, glucose, corn steep liquor, peptone and yeast extract by single factor screen experiment as mixed carbon and nitrogen source. Then, the optimized formula of the culture medium was confirmed through the 4-factors and 3-levels orthogonal experiment. Based on this optimization

6、 of culture medium, the optimized concentration of IPTG and induction time was investigated.Results:Lactose and glycerol were selected as mixed carbon source, peptone and yeast extract were selected as mixed nitrogen source. The expression of hEGF reached 14.8 % at the optimized formula of the cultu

7、re medium (glycerin 1.5 %, lactose 2 %, peptone 0.5 %, yeast extract 1.5 %, NaCl 1%). Meanwhile, the result showed the optimized concentration of IPTG is 1.0 mmol/L and the optimized induction time is 4 h. Finally, wet cell weight of recombinant E.coli in 5 L fermentor was high as 42.3 g/L, and the

8、expression of hEGF reached 15.7 %.KEY WORDS hEGF; E. coli expression system; Medium optimization； Fermentation目录 TOC o 1-5 h z 前 言 4 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 材料与方法 5实验材料 5实验仪器 51.2 实验试剂 61.3培养基及试剂配制 6实验方法 8高表达菌株的筛选 8培养基筛选 9诱导物 IPTG 浓度对 hEGF 表达的影响 11诱导时间对 hEGF 表达的影响 115L 发酵罐小试 11 HYPE

9、RLINK l bookmark16 o Current Document 结果与分析 123.1 高表达菌株的筛选 12培养基筛选 133.2.1 碳源筛选 13氮源筛选 14正交实验 14诱导物 IPTG 浓度对 HEGF 表达的影响 17诱导时间 173.55L 发酵罐小试 18 HYPERLINK l bookmark42 o Current Document 讨论 20 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 参考文献 22 HYPERLINK l bookmark46 o Current Document 致谢 23人表皮生长因子(hum

10、an epidermal growth factor)是由53个氨基酸残基组成的单 链多肽，全长120 kb,分子量为6045 Da,是一种具有广泛生物活性的多肽，能激活 胞外大分子的合成细胞增殖等作用 1。刺激外胚层、中胚层和内胚层细胞增值和分化， 促进组织生长、发育和成熟，因此 hGEF 在医药和化妆品行业上都有广泛的应用前 景，医药上，能加速创伤的修复，可用于烧伤创伤或角膜移植等治疗中，能抑制胃 酸分泌，增强表皮细胞的蛋白质和 RNA 的合成及促进细胞代谢等。 在化妆品工业中， 可减少皮肤皱纹，减少阳光对皮肤的伤害，可加速皮肤新生细胞替代衰老细胞的进 程, 使皮肤年轻化，起到护肤，抗皱，

11、美白，祛斑，防晒，抑制粉刺和青春痘生长，去除斑痕等作用。hEGF作用机理：hEGF通过与细胞膜受体结合，在细胞内的传递过程中，构成 一个复杂的代谢网络来控制细胞的代谢，分化和癌变。当一个体系中有hEGF存在时，它会和 hEGF-R 结合形成复合物，这一复合物有个横向扩散的副效应，平均每 毫秒相碰撞一次，从而导致一些复合物相互聚集形成微丛。 hEGF 受体被固定，经吞 噬作用，微丛中的复合物被细胞吞饮，形成吞饮小泡，吞饮小泡最后与溶酶体融合， 之后酶解，酶解的产物能不断移行到细胞核内，刺激DNA的合成3。hEGF受体的三级结构区具有特异性的酪氨酸蛋白酶活性，hEGF与受体结合诱导受体磷酸化，激

12、活酪氨酸蛋白酶。hEGF受体不仅能自身磷酸化，而且还可以使依赖于Ca2+的分子量 是 35Kd,36Kd 的蛋白质或磷脂酰肌醇磷酸化。使靶细胞核内基因活化， 作用于 DNA 复制相关的酶和细胞增殖有关的基因表达，从而促进细胞的增殖分化。虽然 hEGF 广泛存在于正常生理状态下的几乎所有体液中，如血液，精液，前列 腺液，唾液羊水，组织液，胃液等。体内的多种细胞和腺体也能分泌hEGF，但含量低且提取困难，因此利用基因工程菌生产 hEGF 很具现实意义。目前已有大量文献 报道了 hEGF在重组大肠杆菌中的克隆和表达，证明了其可行性。早在1982年，Smith等人首先用磷酸三脂合成的hEGF部分基因片

13、段置于TrpE 基因下游，形成TrpE-hEGF基因，转化进E.coli k-12菌株，但是表达分泌的hEGF 在胞内即被子蛋白酶分解。1922 年，中科院上海生化所甘人宝等人 5构建 E.coli 碱性磷酸酶启动子及信号肽第 4 页 共 23 页序列-hEGF基因的pAE-8质粒，转化该酶缺失的E.coli变异株K539，得表达菌株EEB, hEGF 产量 1.5 mg/L。在重组短芽抱杆菌系统生产中，1922年，Ebisu等人使用Bacillus brevis47的e 基因的信号肽序列，与合成的 hEGF基因组成一个融合基因，插入表达载体 e的 Hpal-Bam I，将构建出的大小为5.7

14、 kb的质粒转化至Bacillus brevis HPD31宿主菌中， 胞外表达产量最大可达1.1 g/L。2001年，阮文权等人用质粒(UV 5par8egf)菌种(E.coli, JM101)能过质粒转化得 重组菌，并对发酵条件进行优化，实验得出重组菌的hEGF产率最高可达到102 mg/Lo2006年，张海毅等人 用一株大肠杆菌 BL21(DE3)pBLMV-EGF生产hEGF研 究葡萄糖的供应速率对 hEGF的表达分泌的影响。实验结果得出，单位菌株产生的 hEGF水平最高为葡萄糖供应速率为 0.196 g/h时，达hEGF占42 %。2010年，张海淼等人9将重组表达载体 pET3c-

15、SUMO-hEGF转化到大肠杆菌 BL21(AI)中，以阿拉伯糖为诱导剂，对诱导表达参数进行优化，最终表达量约为 20.2%。一直以来，hEGF的表达水平都不高，致其产量低，价格昂贵。因此hEGF的高效表达很有研究价值。本次实验将先通过平板划线获得单菌落，再通过摇瓶培养确 定高效表达菌株，然后通过摇瓶培养确定最佳的培养基碳氮源及其比例。在优化培 养基基础上再进行最佳诱导时间，最佳诱导温度及最佳IPTG诱导浓度等方面进行研 究，确定各参数后在5L机械搅拌通风发酵罐进行小试发酵。2材料与方法2.1实验材料2.1.1实验仪器仪器厂商SW- CJ- IFD单人单面净化工作台苏州净化设备有限公司3K30

16、高速台式冷冻离心机Sigma公司第5页共23页第 页 共 23 页第 页共23页TGL 16G台式高速离心机上海安亭科学仪器厂KDC-160HR高速冷冻离心机科大创新有限公司中佳分公司JJ500电子天平Sartorius 公司台式天平美国双杰兄弟有限公司可调式水浴锅宁波自动化仪器厂SKD-01电热恒温培养箱宁波机电工业研究设计院Arium611纯水发生器Sartorius 公司BCD 268WA低温冰箱华凌公司SHZ-82A恒温振荡器富华公司MDF-V40865超低温冰箱SANYO公司Power Pac-300蛋白电泳槽及电源Bio-RAD 公司微波炉广东顺德格兰氏5 L发酵罐上海咼机实业总公

17、司2.1.2实验试剂名称厂家IPTGPromega丙烯酰胺SigmaN,N-亚甲双丙烯酰胺SigmaAgar广东环凯微生物科技公司LB05酵母膏（总氮8.0 %）安琪乳糖国产分析纯玉米浆（总氮3.5 %）国产分析纯氯化钠国产分析纯葡萄糖国产分析纯蛋白胨（总氮14.5 %）OXOID氨苄青霉素广州市威佳生物科技有限公司1.3培养基及试剂配制IPTG贮备液：用灭菌去离子水配成1 mol/L保存于-20 C冰箱。氨苄贮备液：用灭菌去离子水配成100 mg/L保存于-20 C冰箱。LB 培养基：酵母粉5 g/L ,蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L ,调节pH值至7.0-7.2，高压灭 菌12

18、1 C 20 min, 4 C保存。固体培养基加入琼脂粉15 g/L。SDS试剂：30丙烯酰胺贮备液：丙烯酰胺29 g, N,N-亚甲双丙烯酰胺1 g，蒸馏水定容至100 ml2Xoad ing buffer：Tris Cl(pH 6.8) 100 mmol/L , SDS 4 % (w/v),溴酚蓝 0.2 %(w/v),甘油 20 %(w/v) ，巯基乙醇 5 %(v/v)浓缩胶缓冲液：1M Tris CI(pH6.8)分离胶缓冲液：1.5M Tris Cl(pH8.8)电极缓冲液( 1 L)：Tris-base 3.03 g Gly 14.4 g, SDS 1 g,加水定容到 1 L。染

19、色液：考马斯亮蓝 G-250 0.25%(w/v)，甲醇 45%(v/v)，冰醋酸 10%(v/v)脱色液：95%乙醇(v):冰醋酸(v):水(v) = 25:8:67过硫酸胺( Aps)0.1g溶于1ml超纯水TEMED发酵种子培养基 (1 L)：蛋白胨 10 g,酵母粉 10 g, KH2PO4 2.5g, K2HPO4 1.0 g, NaCl 4 g, pH 7.2，高压灭菌 20 min；发酵培养基( 3 L)：甘油45 ml,乳糖60 g,蛋白胨15 g,酵母膏45 g,氯化钠30 g,消泡剂 1 ml，力卩NaOH调pH调至7.2，高压灭菌121 C 20 min；发酵流加培养基:

20、碳源：50 %甘油400 ml，高压灭菌121C 20min;氮源：10 g蛋白胨，30 g酵母膏溶于400 ml水，高压灭菌121 C 20min2.2实验方法2.2.1高表达菌株的筛选1）通过划线平板培养，获得单菌落，挑取单菌落分别接种到3 ml LB培养液（含氨苄青霉素100血/ml）中，37 C振荡培养8 h,保种（甘油终浓度10 %）,于-80 C冻 存作种子菌；2）菌种按1 %比例接种到3 ml新鲜LB培养液（含氨苄青霉素100旧/ml）中，37 C,250 rpm 振荡培养 5 h（OD6oo= 0.6-0.8），取菌液 1 ml, 12,000 rpm,离心 2 min 收集菌

21、体作为诱导前样品；3）加IPTG至终浓度1.0 mmol/L , 37 C, 250 rpm振荡培养，诱导表达4 h后取菌液1 ml, 12,000 rpm,离心2 min收集菌体作为诱导后样品；4）15 % SDS凝胶电泳：样品处理方法：-20 C冰箱中取出离心好样品，加100瓦水重悬，再加入20卩l6Xoading buffer混匀，沸水中煮10 min, 12000rpm离心10 min，备用于电泳。15%SDS蛋白电泳凝胶配方分离胶（15 %）浓缩胶（4 %）30%丙烯酰胺溶液5mL0.67mLddH2O2.3mL2.7mL1.5M Tris (PH8.8)2.5mL-0.5M Tri

22、s (PH6.8)-0.5mL10%SDS溶液0.1mL0.04mL10%APS溶液0.1mL0.04mLTEMED10d5d电泳操作：将灌注凝胶的玻璃板清洗干净后放在晾架上晾干，按照BIO-RAD公第 页共23页第 页共23页司蛋白质电泳操作说明书的要求，安装好玻璃板。注意检漏，如果有渗漏就要重新 安装玻璃板，确认玻璃板不会漏胶后立即配置按照配方配制15% SDS分离胶,用移液枪迅速并小心加至已安装好的两玻璃板的间隙中，缓慢加入，尽量不要让胶 中有气泡，加到一定位置后预留出灌注浓缩胶所需的空间（大概是泳道的梳子齿长 再加1 cm左右的长度），然后用移液器在两玻璃板的间隙加蒸馏水封住胶面，注意

23、 不要用力太大，让蒸馏水流出压平分离胶的平线，室温垂直放置30 min左右，待分离胶完全聚合后，可以从玻璃表面上看出一条明显清晰的界面，这表示浓缩胶已经 聚合，倾出刚灌注的用来压胶的水，用滤纸或移液器吸净残留液体。再按照配方配 置15 %的浓缩胶，迅速用移液枪在两玻璃板的间隙灌注浓缩胶，液面与一块较矮的 玻璃板平行，立即在插入梳子，小心操作，避免混入气泡，室温下垂直放置。15 min左右待浓缩胶完全聚合后，垂直的拔出梳子，夹板固定在电泳槽上。内 外槽加入已配好的1 XTris-甘氨酸电泳缓冲液，内槽一定要加满，外槽按照规定的体 积添加。最后按预定设计的顺序点样 10瓦，点样时要留心加样的顺序，

24、然后连接好 电源，按恒压方式进行电泳。电泳条件：开始时恒压60 V，当Maker前沿进入分离胶后（大概25-30分钟），提高电压到120V，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电 源，停止电泳。电泳结束后，从电泳装置上卸下玻璃板，标记凝胶方向，小心取出 凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色 5-10 min。蒸馏水清洗两次，再用脱色液脱色，过 20 min换一次脱色液，一直脱至能看清楚电泳的条带。2.2.2培养基筛选单因子碳源筛选，单因子氮源筛选和正交实验过程：100 ml摇瓶，20 ml装液量，加20 ul氨苄青霉素（100 mg/ml），接种后37C, 200 r/min培养，培养5 h后（OD600

25、 值到0.8左右）取样1 ml，离心收集体，-20 C保存。然后加20止IPTG（1 mol/L）诱导，继续培养4 h，停止培养，取样1 ml离心，收菌体，-20 C保存。培养基的单子筛选按表一和表三进行碳源和氮源的筛选；表一单因子碳源筛选培养基试验号碳源蛋白胨氯化钠1甘油1 %1 %1 %2乳糖1 %1 %1 %3葡萄糖1 %1 %1 %高压灭菌121 C, 20 min。单因子氮源筛选培养基：以氮源为基准折算含氮量表二实验用氮源含氮量氮源总氮蛋白含量（总氮x 6.25）酵母膏8.0 %50 %蛋白胨14.5 %90.625 %玉米浆3.5 %21.875 %表三氮源筛选培养基（20 ml）

26、试验号乳糖氮源氯化钠10.2 g酵母膏0.6 g0.2 g20.2 g蛋白胨0.33 g0.2 g30.2 g玉米浆1.37 ml0.2 g高压灭菌121C 20min.培养基的正交实验按表四进行混合碳源和氮源的筛选:表四正交实验培养基试验号甘油乳糖蛋白胨酵母膏氯化钠11 %1 %0.5 %1 %1 %21 %1.5 %1 %1.5 %1 %31 %2 %1.5 %2 %1 %41.5 %1 %1 %2 %1 %51.5 %1.5 %1.5 %1 %1 %61.5 %2 %0.5 %1.5 %1 %72 %1 %1.5 %1.5 %1 %82 %1.5 %0.5 %2 %1 %92 %2 %1

27、 %1 %1 %高压灭菌121 C，20 min。223诱导物IPTG浓度对hEGF表达的影响最佳诱导浓度实验：采用正交实验培养基6作基础培养基，100 ml摇瓶，20 ml装液量，加20瓦氨苄青霉素（100 mg/ml），接种后37 C ,200 r/min培养，培养5 h后 （OD值到0.8左右）取样1 ml，离心收集体，-20 C保存。然后按下表加IPTG诱 导，37 C 200 r/min继续培养，4 h后取样1 ml，12000 rpm离心2 min,收集菌体。15 % SDS凝胶电泳分析hEGF的表达量。表5不同浓度IPTG作为诱导物试验号IPTG 终浓度(um/ml)加入IPTG

28、的体积（d）10020.23.830.47.640.611.450.815.261.01971.222.881.426.82.2.4诱导时间对hEGF表达的影响最佳诱导时间实验：选用正交实验培养基 6为基础培养基，100 ml摇瓶，20 ml 装液量，加20瓦氨苄青霉素（100 mg/ml），接种后37 C ,200 r/min培养，培养5 h后（OD值到0.8左右）加IPTG 20 d诱导，然后每隔1 h取样一次，离心收集菌体，-20 C 保存。6 h后停止培养，取样1 ml，12000 rpm离心2 min，收集菌体。15 % SDS凝胶电泳分析hEGF的表达量。5L发酵罐小试发酵种子培养

29、：1 L摇瓶，200 ml装液量。加100 d氨苄青霉素后接种，37 C ,200r/min 培养 10 h.发酵罐发酵：往罐中加入 3ml氨苄青霉素，通过蠕动泵补料方式将种子移入发酵罐，维持温度37 C，通过调节搅拌速度和通气量控制溶氧在30 %左右。观察pH变化。每隔1 h取样，离心，测湿重，保存样品。发酵进入生长期时溶氧持续下降，当溶氧开始回升时，开始补料。湿重至 30 g/L左右时，加3 ml IPTG进行诱导，每 隔1 h取样待分析。诱导4 h后放罐，离心收集菌体-20 C保存。3结果与分析3.1高表达菌株的筛选通过划线平板培养,获得单菌落，挑取单菌落接种到含100 ug/ml氨苄青

30、霉素的LB培养基 中，培养10 h，再按2%接种量接种新LB培养基（含100 ug/ml氨苄青霉 素）中，培养至ODgoo0.6后取样1 ml，离心取沉淀保存于-20 C冰箱中，作为诱导 前样品。然后加IPTG诱导（终浓度为1 mmol/L） 4 h后取样1 ml，离心取沉淀。诱 导前与诱导后样品处理后进行15 % SDS电泳，检测目标蛋白的表达情况。电 泳结果经拍照后BandScan扫描分析，1-7号菌目的蛋白占总蛋白含量分别约为 7.5 %，8.7 %，10.5 %，10.3 %，0 %，14.1 %，12.3 %。其中表达量最高的是 6号菌株，因 而用来作为本次实验种子菌。（图1）kDa

31、 前 1234 M 567116. 0图1 SDS电泳分析表达菌株的表达水平前：诱导前样品；1-7:菌株号M: Middle Molecular Weight Protein Markers3.2培养基筛选321碳源筛选以蛋白胨为唯一氮源，分别用甘油、乳糖、葡萄糖为不同的碳源，按表一配制培养基进行培养，取各诱导前后样品处理后，经 15 % SDS电泳后，拍照得到 下图（图2），再经BandScan扫描分析后得出各配方hEGF的表达量：1号诱导前， 诱导后；2号诱导前，诱导后；3号诱导前，诱导后中hEGF分别约占总蛋白含量0 %，3.2 %； 2.5 %，15.2 %； 0 %，11.6 %。其

32、中2号和3号培养基明显比1号培养基的 hEGF表达量更高，2号培养基因为选用乳糖为碳源，乳糖对菌体（含有乳糖操纵子） 起到诱导作用，因而诱导前菌体也有表达。综合考虑，以 2号3号培养基碳源（即 乳糖，甘油）作为本次实验的混合碳源。图2 SDS电泳分析碳源的筛选1前2前3前：1,2,3号试验诱导前样品；1后2后3后：1,2,3号试验诱导后样品；M: Middle Molecular Weight Protein Markers322氮源筛选选用乳糖作为唯一碳源，分别用酵母膏，蛋白胨，玉米浆作为不同的氮源，按 表三配制培养基进行单因子试验。实验过程中发现以玉米浆为氮源时，菌浓度很低 或不生长，经多

33、次实验确定玉米浆不适合作为本次实验氮源。在不同培养基中培养 并进行诱导，取各诱导前后样品处理后经15 % SDS电泳后拍照得下图（图3）， 再经过BandScan扫描分析后得出各试验号诱导前后 hEGF占总蛋白的含量：1号诱13.4 %；因而选导前，诱导后；2号诱导前，诱导后；3号诱导前，诱导后，分别为10.7 %，10.2 %，12.5 %； 0 %，0 %。1号2号配方中诱导后hEGF表达量差异不大, 用1号，2号配方氮源（即蛋白胨，酵母膏）作为本次实验的混合氮源。66. 245.035.025.0图3 SDS电泳分析氮源的筛选LkDa16.018.414.41前2前3前：1-3号试验诱导

34、前样品；1后2后3后：1-3号诱导后样品；M: Middle Molecular Weight Protein Markers3.2.3正交实验实验以甘油、乳糖作为混合碳源，以酵母膏、蛋白胨作为混合氮源。分别的1 %和 2 %三个水平作 四因素三水平”正交实验（氮源比例以蛋白胨为准折算含氮 量），按表四配制培养基后作试验。在不同培养基中培养并进行诱导，取各诱导前后样品处理后经15 % SDS电泳后拍照得下图（图4-6），再经BandScan扫描后得出各试验诱导前后hEGF的表达量。表6正交实验各种不同培养基对hEGF表达量的影响拉伞甘 培养基1号后2号3号4号诱导刖刖后刖后刖后表达量（%）1.

35、59.88.79.89.612.36.58.05号6号7号8号9号前后刖后刖后刖后刖后9.012.13.314.810.211.510.012.89.412.5由此可知，配方6较其它配方hEGF表达量更高，因而选用配方 6作为本次实验的基本培养基。1前1后366.215.035.025.0184144图4: SDS电泳分析正交实验的筛选 （1-4号）M kDa116.01前-4前：1-4号实验诱导前样品；1后-4后：1-4号实验诱导后样品;M: Middle Molecular Weight Protein MarkerskDa116.0gflft7后7前6,后6前54神M8J66. 245.

36、 035. 025.018. 414*4图5: SDS电泳分析正交实验的筛选 （5-8号）5前-8前：5-8号实验诱导前样品；5后-8后：5-8号实验诱导后样品;M: Middle Molecular Weight Protein Markers图6: SDS电泳分析正交实验的筛选 （9号）9前：9号实验诱导前样品9后：9号实验诱导后样品M: Middle Molecular Weight Protein Markers3.3诱导物IPTG浓度对hEGF表达的影响以正交配方6为基本培养基，接种培养 5 h (OD6000.8)取样1 ml，离心取沉淀 作为诱导前样品，然后按表5添加IPTG量进

37、行诱导，培养4 h后取样与诱导前样品 一起，处理后经15 % SDS电泳后，拍照得下图(图 7)，经BandScan扫描分 析后得出各种IPTG浓度诱导后hEGF的表达量：诱导前约为3.5 %，诱导浓度0 mmol/L , 0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L , 0.6 mmol/L, 0.8 mmol/L，1.0 mmol/L，1.2 mmol/L，mmol/L 时 hEGF表达量分别约为：5.3 %，6.8 %，8.4 %，11.5 %，13.0 %，14.8 %， 15.0 %，15.1 %。由此可知，hEGF的表达量在范围内随IPTG浓度增加而增加，诱 导浓度为1.0 mmo

38、l/L时hEGF的表达随着IPTG浓度影响不大，从节约成本角度考虑， 最终确定1.0 m/ml的诱导浓度为最适IPTG诱导浓度。kDa1!6.066245.035.025.018.414.4图7: SDS电泳分析IPTG浓度对表达量的影响前：诱导前；1-8 : IPTG 终浓度分别为 0,0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 mmol/L 诱导后;M: Middle Molecular Weight Protein Markers3.4诱导时间以配方6为基本培养基，接种培养5 h后，加IPTG诱导至终含量为1.0 um/ml，6 h内每隔1 h取样一次，离心取沉淀

39、于 -20 C冰箱保存。样品经处理后进行SDS电泳，拍照得下图（图8）,再经Ba ndSca n扫描分析，得出各样品中hEGF 含量分别为：诱导前3.1 %; 1 h约4.8 %; 2 h约8.0 %; 3 h约11.6 %; 4 h约14.1 %;5 h约14.3 %; 6 h约14.5 %。由此可知，诱导后 4 h-6 h，hEGF表达量较高，5 h和 6h比4 h略高，但从生产节省能耗角度考虑，最终确定诱导后 4 h为最适诱导时间。前 12 M 3116.066.2图8: SDS电泳分析不同诱导时间对hEGF表达量的影响45.035+025.018.414.4前：诱导前；1-6 :分别为

40、诱导后1h, 2h, 3h, 4h,5h, 6h样品M: Middle Molecular Weight Protein Markers5 L发酵罐小试取-80 C冻存甘油菌种1支，1： 1000接种于LB培养基中（200 ml装液量/1 L 摇瓶），37 C, 200 r/min培养8 h-10 h后移入发酵罐（3L装液量/5 L罐）。发酵结果如图9-11所示，工程菌接种后0-3 h内，菌体湿重增加缓慢，菌种处 于适应期；3 h后，菌体进入开始高速生长期，开始流加氮源；4.5 h左右，开始补加碳源；当湿菌重达到30 g/L时，暂停流加甘油使菌体处于饥饿状态并维持30 min。加入1 mmol

41、/L终浓度的IPTG进行诱导，并于诱导1 h后开始缓慢流加甘油，使pH 值维持在7.2左右，此时，菌体仍有缓慢生长，但其比生长速率要远低于高速生长期。 目的蛋白hEGF的表达，随着时间的增加而也增加。在诱导 4 h后，融合蛋白表达量 达到最大值15.7 %，始时的菌体湿重为42.3 g/L。g(重湿time(h)图9发酵过程湿重随时间关系123456789105 0 5 0 量达11time(h)图10发酵过程hEGF表达量随时间关系M kDa97.266444.329,020.114.3图11 5 L发酵罐中SDS分析hEGF的表达情况1:发酵诱导前，2:发酵诱导后4 hM: Middle

42、Molecular Weight Protein Markers4讨论目前，人们通过基因重组技术，利用酵母菌，大肠杆菌等都能成功生产hEGF,但就目前而言，相对于其它表达系统来说大肠杆菌表达系统更加适合用于生产。因 为大肠杆菌表达系统有以下优势：（1）人们对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究 已相当彻底，便于生产中发现问题，解决问题。（2）尽管大肠杆菌细胞的空间小，但 繁殖能力强，在营养条件充足时，2030min即可繁殖一代，发酵周期短，而且大规 模发酵成本低，具有巨大的生产潜力。（3）表达水平一般较其它表达系统高，某些 外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5%30 %，且下游工艺简单、易于

43、控制。因而用重组大肠杆菌生产 hEGF更利于生产的控制及降低生产成本。传统的生产工艺都是以葡萄糖为单一碳源，但由于葡萄糖被菌体利用后低谢产 生乙酸，乙酸的生成和积累不仅抑制了菌体的生成，而且降低外源蛋白的表达效率， 使得hEGF表达量降低。因而实验用甘油，葡萄糖和乳糖三种碳源作比较，设计单第 页 共 23 页第 页共23页因子实验，实验结果得出甘油和乳糖相对葡萄糖更适合用于生产hEGF。以乳糖为碳源的实验中，由于乳糖本身起诱导作用，因而培养开始后菌体合成 和表达同时进行，这样优点是单位菌体的表达量上升了，缺点是菌总浓度会因此降 低，大肠杆菌在培养时，乳糖启动乳糖操纵子，进行蛋白质的表达，消耗的

44、能量除 了用在菌体合成方面，还用于蛋白质表达方面，使大肠杆菌的生物量（菌体）有所 下降，因而在总表达量上，用乳糖为碳源时的优缺点需另作研究。在氮源筛选中，发现用玉米浆作为氮源时，菌体浓度过低甚至不生长。也没有 发现 hEGF 的表达。原因是玉米浆的酸度过高，大肠杆菌在培养基中难以生长，且 与 hEGF 表达阶段 pH 要求的 7.2 左右相差太远，因而不适用作为生产用氮源。在研究IPTG诱导浓度对hEGF表达量的影响中，发现所选范围内hEGF表达量 随诱导浓度的增加而增加，但 1.4 mmol/L 的诱导浓度和 1.0 mmol/L 的诱导浓度对 hEGF 产量的影响相差不大，由于诱导物 IPTG 价格较昂贵，因此生产过程中应尽量 节省 IPTG 的用量。因此选用浓度较低而效果显著的 1.0 mmol/L 终浓度作为生产的 最适诱导浓度。在探索诱导时间内 hGEF 表达量的实验