凝胶柱层析分析蛋白质分子量大小

1、凝胶柱层析分析蛋白质分子量大小第1页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一一. 实验目的 掌握凝胶层系的原理、测定蛋白质分子量大小的方法 熟悉并掌握分子实验相关仪器的应用及操作第2页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一二. 实验原理层析技术：是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在两相中 ，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术所有的层析系统都由两个相组成 ： 固定相 ：是固体物质或者是固定于固体物质上的成分（可以为固体、液体） 。 流动相 ：即可以流动的物质，如水和各

2、种溶媒（可以为液体或气体）第3页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一二. 实验原理名称分离原理吸附层析法固定相是固体吸附剂，组份在吸附剂表面吸附力不同,疏水力或静电引力分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同，溶解度离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同，离子间结合力凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同，排阻效应亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，亲和力按原理，层析分类第4页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一二. 实验原理 凝胶层析 凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻

3、层析或分子筛层析，是利用生物大分子相对的分子质量差异进行层析分离的方法。凝胶颗粒内部呈网状结构，筛孔直径一致。待分离的物质中，分子量大的分子分子直径大，无法进入凝胶颗粒网状结构的小孔穴内，它会从凝胶颗粒的间隙里通过，因此流出速度快；分子量小的分子会进入凝胶颗粒网状结构的小孔穴中穿行，因此流出速度慢 第5页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一第6页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一二. 实验原理 凝胶层析 样品中各组分的流出顺序，可用分配系统Ka来量度 Ka=(Ve-Vo)/Vi Ve：为洗脱体积，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积 Vo：

4、外体积，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（可以用凝胶干重与湿重之差计算而得到） Vi：内体积，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积（用分子量很大的物质实际测量而计算得到） 第7页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一二. 实验原理 凝胶层析 当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出 若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出 Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出 ，Ka值大的后流出。在限定的条件下，Vi和Vo都是恒定值 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱

5、液的体积等于Vo+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反常现象说 明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程 第8页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关（Ve为洗脱体积）LogM=k1-k2Ve先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测V测第9页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一柱层析装置(恒流泵 层析柱 收集器 主机 记录仪等5件套) 三

6、. 仪器和试剂第10页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一四. 操作步骤 装柱：凝胶溶胀后，湿法装柱，以柱床均匀、无气泡表面平整为佳系统平衡：连接各装置，用缓冲液洗涤柱子，并打开检测器，使检测器稳定上样：分别加标准分子量蛋白质和1ml 血清。洗脱、记录结果计算及分析第11页，共13页，2022年，5月20日，9点1分，星期一 注意事项 要通过实验合理调整流速、检测器和记录仪的灵敏度，和记录仪的走纸速度，才能获得良好的洗脱曲线 若峰有重叠，宜加长柱子，降低流速 若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快流速，降低走纸速度 峰过高，可减少加样量，或降低检测器和记录仪的灵敏度 峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量。 第12页，