医学免疫学课件：第七章 荧光免疫技术

1、第七章 荧光免疫技术荧光抗体技术(荧光显微技术)荧光免疫测定均相荧光免疫测定（homogeneous fluorescence immunoassay） 非均相荧光免疫测定（heterogeneous fluorescence immunoassay）荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术的类型抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法荧光的产生： 物质在光的照射下吸收光量子而激发，在回复基态时释放出光，该光波的波长比入射光的波长长，

2、这种发射光称为荧光。 这种物质，称为荧光素 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。荧光效率：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:荧光效率= 荧光的基本知识荧光寿命：荧光衰减到一定程度(1/e)所需的时间荧光猝灭现象：荧光减弱甚至消失的现象。荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素 (FITC)490495nm520530nm （黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明 (RB200)570575nm595600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异

3、硫氰酸罗丹明 (TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 常用的荧光物质 二、荧光物质第二节 荧光抗体的制备荧光抗体技术的基本原理 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。荧光抗体技术的

4、内容 荧光抗体制备 标本制作 荧光抗体染色 荧光显微镜检查抗体要求 高特异性 高亲和力 一般采用单克隆抗体 采用抗血清，需经纯化提取IgG 一、荧光抗体的制备有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光抗体的制备抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法

5、: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低。荧光抗体的制备去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤荧光抗体的纯化荧光抗体的制备荧光素与蛋白结合率： F/P=F/P比率越大，表明抗体分子结合的荧光素越多。用于固定标本染色的荧光抗体，F/P比率以1.5为宜，活细胞染色时，比率为2.4为宜。抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备-20：保存12年真空干燥：长期保存荧光抗体的保存荧光抗体的制备组织切片：冷冻切片、石蜡切片印片：肝、

6、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞标本的类型二、标本的制作冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。非特异性强，很少用于荧光抗体技术组织切片的类型标本的制作固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保 存：4、-20标本的固定和保存标本的制作直接法直接荧光抗体染色法示意图 荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。三、荧光抗体染色及结果判断间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。 间接荧光抗体染色法示意图 荧光抗体染色及结果判断双标记法 两种荧光素分别标记的两种不

7、同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色及结果判断 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断 “-”：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “+”：荧光明亮。 “+”：耀眼强荧光。特异荧光强度“+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“”。根据呈+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断荧光显微镜 利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 四、荧光显

8、微镜的基本结构光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头 荧光显微镜荧光显微镜的基本结构荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定自发荧光寿命短:1ns10ns镧系元素寿命长:10s1000s短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光 基本原理时间分辨检测原理示意图时间分辨一

9、、时间分辨荧光免疫测定stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠，很容易用滤光片把激发光和发射光分开，消除激发光散射引起的干扰。stokes位移基本原理时间分辨荧光免疫测定镧系元素发射光谱带较窄：613nm10nm，本底荧光波长通常在350-600nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm350nm，灵敏度高基本原理发射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高基本原理荧光标记物的相对比活性时间分辨荧光免疫测定结合-二酮体Eu3+解离酸性增强液荧光增强

10、Eu3+标记抗原抗体复合物基本原理信号增强时间分辨荧光免疫测定免疫反应完成后 镧系元素铕(Eu3+)（最常用）钐(Sm3+)铽(Tb3+)钕(Nd3+)镝(Dy3+)标记物荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0常见荧光物质的荧光寿命时间分辨荧光免疫测定标记方法镧系元素粒子不能直接与抗原或抗体分子结合，需利用双功能螯合剂一端与

11、抗体或抗原分子的氨基结合，另一端与镧系元素结合。 双功能螯合剂：1-（对-苯偶氮）-EDTA异硫氰酸苯基-EDTA异硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸（DTPA）标记方法：一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+时间分辨荧光免疫测定方法类型 双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法时间分辨荧光免疫测定方法类型时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图双抗体夹心法固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。时间分辨荧光免疫测定方法类型固相抗体竞争

12、法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定方法类型固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：45个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高方法评价时间分辨荧光免疫测定荧光偏振免疫分析技术（fluorescence polarization immunoassay,FPIA）是利用荧光素经单一波

13、长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比。 光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。偏振荧光(绿光,525nm550nm)偏振光(蓝光,485nm)荧光物质基本原理二、荧光偏振免疫测定 抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图 基本原理荧光偏振免疫测定方法评价 样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好 快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免

14、疫测定法低荧光偏振免疫测定基本原理荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。三、荧光酶免疫测定酶和荧光底物荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物 标记酶底物荧光产物激发光(nm)荧光(nm)相应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶HPA二聚体3174140.03荧光酶免疫测定方法类型 双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法荧光酶免疫测定方法类型双抗体夹心法固相抗体和酶标记抗体与待检原反应，形成固相抗

15、体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图 荧光酶免疫测定方法类型双抗原夹心法 固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。 荧光酶免疫测定方法类型固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。荧光酶免疫测定方法评价 用酶和荧光底物的化学反应 作为放大系统，提高灵敏度背景荧光干扰测定，用固相 荧光酶免疫测定效果好荧光

16、酶免疫测定自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)第十一章 固相膜免疫技术 随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。第一节 概述 标记免疫测定放射免疫测定 1960酶免疫测定 1970荧光免疫测定 19801990化学发光免疫测定 1990膜固相免疫测定 1990一、免疫测定分类免疫浊度测定Ag + Ab AgAb + Ab标记免疫测定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （B） （F）四、固相膜的特点多孔性 毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原

17、 高度敏感性易于漂洗 操作简便固相膜是以微孔膜作为固相，具有以下特点：五、常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜六、固相膜的技术要求孔径：0.20.6 m 指能通过粒子的大小流速：以ml/cm2/min表示 孔径大，流速大蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cm2表示均一性 优质的膜应具有良好的均一性固相NC膜第一节 免疫胶体金组化技术胶体金是氯金酸的水溶液，具有亲电子密度，并能与多种生物大分子结合，成为继荧光素、放射性核素和酶之后的另一种非放

18、射性视踪物。目前是免疫组织化学中较常用的敏感方法之一。一、免疫胶体金标记的原理溶胶的概念： 溶胶是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。按分散相质点的大小不同，分三类。(1)离子分散体系 分散相以小分子或离 子状态存在（分散相粒子小于1nm）。 具有高度的稳定性。(2)胶体金分散体系 指分散相颗粒在1 100nm之间，外观透明不浑浊，在普通 显微镜下看不见。(3)粗分散体系 指颗粒大于100nm，不稳 定，显微镜下可见。胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作

19、用成为一种稳定的胶体状态。标记原理：金颗粒表面负电荷与蛋白质正电荷之间非共价键的静电引力相互吸引，当达到范德华引力半径范围之内时，蛋白质与金颗粒表面形成牢固结合。但不影响蛋白质的生物活性和免疫活性。三、胶体金的制备1.制备前的准备(1)玻璃器皿的清洁 制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。其清洁流程如下：清洁液泡24h，流水洗净，洗洁剂洗34次，流水冲洗干净，蒸馏水洗45次，烤箱烤干备用。如果条件允许，可将器皿进行硅化。2.胶体金制备的方法 胶体金的制备方法很多，其中应用较为广泛的方法是化学还原法。基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的还原剂，使金离子还原成金原子。常

20、用的还原剂仅三种：即白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸。3.胶体金的质量鉴定 胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定，金颗粒间大小的均匀度鉴定。 理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。如果总数超过10以上大小不等的金颗粒及椭圆形、三角形金颗存在应重新制备。胶 体 金（Colloidal Gold）1560 nm优 质劣 质不同大小的胶体金颗粒有不同的适用范围：5 nm以下的颗粒适用于标记抗原或组织化学法检测。5-20nm的颗粒适用于液相免疫检测。20nm以上的颗粒多用于免疫沉淀试验。在免疫金银试验中，小颗粒胶体金可提高标记物的稳定性和敏感性。 二、免疫胶体金标记物制备1 影响标

21、记效果的因素：（1）胶体金pH。调整胶体金pH至标记蛋白等点略偏碱时易形成牢固的结合物。（2）待标记物的电解质影响标记效果，可先经透析或超速离心去除多余的电解质和聚合物。（3）胶体金与待标记物用量的比例非常重要，经预试验确定最佳比例。（4）加入稳定剂，使标记物稳定。（BSA,PEG）2.胶体金与标记物的结合（1）按最适用量比例，将胶体金加入蛋白质溶液中，10min后加入稳定剂。（2）离心，取沉淀物溶解，即为初提的免疫金标记物。3. 胶体金标记物的纯化与鉴定（1）标记物的纯化 超速离心和凝胶过滤法（2）标记物的质量鉴定电镜下测定颗粒大小，均匀程度。用免疫组化滤纸模型鉴定特异性和敏感性。4.胶体金

22、探针的保存 标记物加入稳定剂后在4中，可稳定数月。在甘油中-70 可保持更长时间。膜固相免疫测定的特点第三节膜载体免疫测定的种类与原理优点不足之处简便，快速敏感度略低，价格略高（与ELISA比）单份测定精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志心肌标志滥用药物固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）斑点ELISA (dot en

23、zyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 一、免疫渗滤测定(IFA)原理：斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）是将抗原或抗体点在固相载体上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜，依次滴加标本、免疫胶体金及洗涤液等试剂发生反应，抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上形成红色斑点。常用方法：双抗体夹

24、心法测抗原间接法测特异性抗体IFA双抗体夹心法测抗原ABIFA结果判断二 免疫层析实验免疫层析实验（immunochromatography asay, ICA）的原理与IFA相同，不同点在于液体的流动不是通过直向的穿流，而是基于层析作用的横流。最先应用的标志物是胶体硒，现在均用胶体金。 ICA双抗体夹心法测抗原 A G T C BG 金标抗体 T包被抗体 C 包被抗金标抗体 B吸水纸 ICA 结果观察 阳性阴性无效优点：方便快捷。缺点：1、钩状反应； 2、灵敏度问题：检测信号由胶体金颗粒聚 集产生，检测信号未经放大；经肉眼判 断，无仪器检测； 3、质量控制问题： “阳性”对照是抗鼠IgG，是

25、抗胶体金标记抗体，与实际检测的免疫结合反应不同(形成固相检测抗体-目的检测物-标记抗体固相检测抗体夹心免 疫复合物)，其作用仅限于反应标记物是否失效、层析或渗 滤过程是否正常等，不能作为评价固相抗体是否失效，也不 能用于评价敏感性等质量指标。 斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA其实验原理与常规ELISA相同，不同点：所用载体为NC膜，对蛋白质具有强吸附力。酶作用底物后，使NC染色。优点：NC膜吸附蛋白力强，灵敏度较ELISA高6-8倍；试剂用量少；操作简便，NC膜可长期保存，不必影响活性。斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA免疫印迹法Westernblot法原理Westernblot抗原

26、表位可能被破坏而漏检将电泳的高分辨率和抗原抗体反应的特异性相结合第十二章 免疫组织化学技术 (immunohistochemistry)组织化学：指在组织和细胞上进行化学反应，用颜色的变化，判断组织细胞中的化学成分。（碘，普鲁士兰）免疫组织化学（简称免疫组化）：是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物（如酶、金属离子、同位素等），对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。特点：免疫反应的特异性，组织化学的可见性，显微镜的显象和放大作用结合，在细胞和亚细胞水平检测抗原和抗体。GFP expression in tongue第一节 概述根据标记物（

27、酶、荧光素和金属离子）的不同，免疫组化分类如下：酶免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术亲和免疫细胞组织化学技术免疫金细胞染色组织化学技术免疫标记电镜技术等第一节 概述免疫组化的全过程：（1）抗原的提取与纯化（2）抗体的产生（3）抗体的标记（4）标本的处理（5）抗原抗体反应和呈色反应（6）显微镜下的结果观察在抗体商品化以前或者对新表达的蛋白进行定位，都要进行全程免疫组化。 一、标本的收集与处理 IHC染色成功与否及其质量如何，除染色方法本身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、固定、脱水、包埋、切片等。 目的：保存好Ag的数量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。第一节 概述一、标本的处理（一

28、）标本的主要来源：活体组织、各种体液和穿刺液、培养细胞取材新鲜，固定及时，形态保存良好，抗原性不被破坏。（一）组织标本的取材与储存 来源：活检取材、实验动物组织等。 要求：取材于病变组织、要快、要小（110.4cm），避免挤压。 处理：冰冻即用或保存；固定即用或保存。（二）细胞标本的取材与储存来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定； 细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定；对于体外培养细胞：贴壁生长细胞（内皮C、纤维C、神经C等）在培养皿底置载玻片；悬浮生长细胞需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。 第一节 概述（二）标本的固定与保存1. 标本固定的目的防止组织

29、自溶，防止标本脱落，保存某些特殊的抗原。2. 固定对抗原性的影响主要有以下3个方面：（1）固定不足致使部分抗原溶解或丢失。（2）固定时间过久可导致组织抗原性降低（3）不同种类的固定液及其固定液的浓度对抗原性的影响也不同。固定的原则：不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合根据不同的抗原选择不同的固定剂。第一节 免疫组织化学技术要点2. 固定剂的选择（1）能快速固定抗原；（2）防治抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应。（蛋白类抗原可用乙醇或甲醇；微生物抗原可用丙酮等）常用的固定剂：福尔马林、戊二醛、丙酮或乙醇等第一节

30、概述3. 包埋和切片 （1）包埋的目的是使组织保持一定的形状和硬度，便于切片。 石蜡包埋 石蜡作包埋剂.冰冻包埋 常用的包埋剂是OCT（2）切片要求薄而且平整, 片厚在4um以下。（a）冰冻切片：首选，适用于不稳定抗原（b）石蜡切片：研究形态学的主要方法，可长期保存。第一节 概述（三）抗原修复抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。所以，使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。第一节 概述（三）抗原修复甲醛固定 封闭抗原决定簇 导致染色结果不理想 抗原修复 去除肽键、酰胺键等抗原表面结构，使抗原

31、决定簇重新裸露常用的方法：酶法：胰蛋白酶非酶法：微波炉抗原修复、高压锅抗原修 复、EDTA等第一节 免疫组织化学技术要点二、抗体的处理与保存注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低抗体稀释的原则：阳性标本着色应鲜明，背景应浅或不着色。抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度抗体的保存根据厂家提供的保存条件保存，一般在48条件下保存。分装密封保存，避免对抗体的污染，并注明标记（批号、名称、效价、量），避免与挥发性有机溶剂同放一室。避免反复冻融而使抗体效价降低，有些抗体只能用于冰冻组织而不

32、能用于石蜡包埋组织的抗体。四、对照（Control）不仅在科研时要设对照，在进行病理诊断时更应设严格的对照。常用的对照实验包括：阳性对照、阴性对照和确证实验。 （一）阳性对照 即用含有已知靶抗原的组织切片与待测切片一起染色，结果应为阳性，说明染色成功。如该对照片为阴性说明Ab或染色过程有问题。（二）阴性对照 用确证不含已知抗原的标本做对照，结果呈阴性。主要目的在于排除假阳性。（三）确证实验1.替代对照用与一抗同种动物的正常血清（不含特异性抗体）来代替抗，其余染色步骤不变，结果应为阴性。以确认阳性反应不是异嗜性抗原所致的非特异性反应。2.空白对照 用PBS代替抗,其余步骤不变,结果应为阴性。 以

33、排除组织细胞内所含的生物素或内源性酶等。3.吸收实验 用足量的抗原与抗混合、搅拌、离心、过滤，然后用上清液代替抗进行染色，此时已知阳性标本应呈阴性或弱阳性。用于确认免疫组化的阳性反应是与天然抗原相同的抗原抗体反应。第一节 概述五、免疫组化结果判断免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱阳性；棕黄色，为中等度阳性；棕黑色，示为强阳性。在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。阳性标记细胞学特征 免疫组化标记中，阳性标记细胞学特征是反映抗原在细胞中的定位和分布情况。根据抗原在细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位可分为以下3

34、种类型：胞膜型胞核型胞浆型 1.胞膜型 阳性颗粒主要分布于细胞膜表面，形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞。此类型常见于某些膜抗原，如上皮膜抗原（EMA）、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原（GAA）等。 2.胞核型 阳性颗粒定位于细胞核，呈均匀分布或位于核膜下，有的呈小斑块状不规则分布。此多见于增殖细胞核抗原、孕激素受体（PR）和基因p53等。3.胞浆型 阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗原均属于此种类型，如细胞角蛋白、结蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白及前列腺特异性抗原（PSA）等。依据抗原在胞浆内分布形式，通常表现为弥漫性分布或局限性分布。阴性结果和抗原不表达阴性结果:不能简

35、单认为具有否定意义， 因为阳性表达有强弱、多少之分，只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要视为阳性表达,不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。特异性染色与非特异性染色特异性染色非特异性染色分布在特定的部位, 具结构性无分布规律，常出现在切片边缘、刀痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域 由于细胞内抗原含量不同，所以显色不均一不限于单个细胞，而是累及一片细胞，均匀显色阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片上显色强度不一细胞和周围的结缔组织均无区别的着色第一节 概述非特异性染色的控制： 是否有效地去除了内源性酶和生物素。 是否选择使用了正确的封闭血清。 所选择的抗体是否符合试验要求。 一抗的使用浓度是否

36、过高。第一节 概述 清洗是否充分。 DAB的使用是否正确。 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。第一节 概述复染为了在免疫组化染色完成后,能够衬托出组织结构以利于结果的分析,就要用其他的染料进行复染.常用的复染剂有苏木精, 甲基绿和固红等. 免疫组化结果与HE染色结果 当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时, 应再结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线等影像学及实验室结果综合分析, 不能简单地推翻HE切片诊断。五、质 量 控 制 抗体特异性、敏感性测试 抗体最佳稀释度的选择 稀释剂 抗体孵育温度、时间试剂的质量控制操作过

37、程质量控制操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作 人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型 质控品，可用于监控标本制备、操作过程、 染色步骤、试剂质量等问题引起的误差仪器的质量控制相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒减少对抗体污染的机会第二节 免疫荧光组织化学技术定义:采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。 免疫荧光技术的不足 需要荧

38、光显微镜 荧光衰减,不能长期保存 定位不准确一、组 织 的 处 理标本的类型：涂片和印片 血液、体液等可直接涂片，脏器、尸体病变组织可压印于玻片上做成印片 组织切片1.冷冻切片：组织抗原性保存好，但组织结构欠清晰。2.石蜡切片：研究形态学的主要方法，但有组织自发荧光和非特性荧光，需加酶消化处理。细胞培养标本 直接在玻片上培养，然后固定检活细胞 检测淋巴细胞表面抗原等，可用活细胞荧光看。标本的保存 ： 标本固定干燥后，最好立即检测 保持干燥、置4甚至-20 以下保存 一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可在4保存1月以上 病毒和某些组织抗原，其抗原性丧失很快，数天后失去抗原性，需在-20以下保存。

39、荧光免疫组织化学的染色方法：直接法间接法双标记荧光免疫法 非特异性荧光产生某些组织细胞、衰老细胞有自发荧光抗体不纯所出现的交叉反应标记抗体质量差，游离荧光素干扰 标记抗体浓度过高免疫荧光染色时间过长洗涤时间不够 非特异性荧光消除用非免疫血清或10%牛血清白蛋白温育切片封闭非特异抗原位点动物肝粉吸收荧光抗体中非特异性成分层析或透析去除游离荧光素，纯化荧光抗体将抗体的浓度调整到高稀释度选择适合的切片方法封固剂、镜油必须无自发荧光用高渗盐浸洗，降低非特异性染色背景 第三节 酶免疫组织化学技术定义:在一定条件下，应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应，催化底物产生显色反应，通过显

40、微镜识别标本中抗原(抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。酶免疫组化 免疫学(抗原抗体反应) 酶细胞化学(底物显色反应)+特异性 敏感性 定位性 可视性一、组织处理 常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等。与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点。 免疫酶组织化学基本组成：抗原 抗体 放大系统 显色系统酶免疫组织化学技术分为：一、酶标记抗体技术直接法和间接法二、非标记抗体酶技术酶桥法和PAP法等 酶标记抗体法 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合

41、在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。 一、直接法该法使用最早 原理：HRP标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原- 抗体 HRP复合物 组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法特点：方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻。但敏感性差，每种抗体均需单独标记，使用不便。二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原-特异性抗体-第 二抗体 HRP复合物组织抗原第一抗体第二抗体过氧化物酶间接法特点：敏感性较直接法高但低于酶桥法和PAP法。一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。较直接法费时，非特异染色稍重。 二、非标记抗体免疫酶 组化染色法基本原理： 酶免疫动物(与

42、待测抗体的动物种属相同)制备抗酶抗体 酶与抗酶抗体结合形成复合物 底物显色，检测抗原特点：避免了酶标记抗体，提高了检测敏感性。 （一）酶桥染色法基本原理组织中的抗原与一抗结合形成免疫反应系统，二抗（桥抗体）与抗酶抗体和一抗结合，加入酶与抗酶抗体形成复合物，通过酶的底物显色而检测抗原。酶桥法组织抗原第一抗体(兔)第二抗体（羊抗兔）第三抗体（抗酶抗体）（兔）HRP（二）PAP法（peroxidase anti-peroxidase）PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物) 原理：抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP复合物-底物

43、显色组织抗原第一抗体第二抗体PAP复合物PAP法HRP特点： 敏感性较高，背景染色较轻但特异性抗体与PAP必须为同一种属动物，已经逐渐取代酶桥法。二、双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物 双PAP法组织抗原第一抗体第二抗体PAP复合物HRP特点：敏感性较高 但步骤多，费时，非特 异背景重APAAP法：有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色时就不宜使用HRP体系。用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶(AAP)法，简称

44、APAAP法+底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源APAAP复合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-APAAP复合物酶选择标准： 酶用细胞化学易于检出，能被光镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。 酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 酶在PH中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物常用种类: 辣根过氧化物酶/HRP 底物显色棕色或灰蓝色，HRP穿透力强，易进入细胞内 最常用 碱性磷酸酶/AP 底物显色玫瑰红色或深蓝色 最敏感 葡萄糖氧化酶/GO 底物显色蓝色 敏感性较低，显色底物不易保存酶的

45、选择: HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰第四节 亲合组织化学染色 亲和组织化学（Affinity histochemistry）是利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素、生物素和葡萄球菌A蛋白等，都对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、酶、同位素等结合,采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应等，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。一、生物素-亲合素法 生物素/Biotin: 即维生素H，是一种碱性蛋白。 亲合素/Avidin:也被称为抗