干细胞专题知识讲座

1、干细胞专题知识讲座干细胞专题知识讲座第1页2多年来在干细胞理论和技术研究方面取得了长足进展。1999 年12 月,美国科学杂志把干细胞生物学和以干细胞临床应用为内容干细胞生物工程评为20 世纪世界科学进展最主要领域。已经成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景生命科学研究领域之一。干细胞专题知识讲座第2页内 容第一节 干细胞生物学第二节 干细胞工程原理与技术3干细胞专题知识讲座第3页第一节 干细胞生物学干细胞定义和生物学特点干细胞分类干细胞自我更新与分化调控4干细胞专题知识讲座第4页干细胞定义干细胞（Stem Cells）是一群未分化，含有自我更新 (self-renew

2、al) 能力和多向分化 潜能(potency)细胞。它既能产生表型与基因型完全相同子代细胞；也能产生组成机体各组织和器官高度分化细胞。5干细胞专题知识讲座第5页干细胞起源和进展1896 E.B Wilson首次用这个名词描述寄生虫生殖系祖细胞1963 Till和McCulloch发觉小鼠骨髓中存在能够自我更新细胞1968 骨髓移植治疗重症联合免疫缺点综合症(SCID)取得成功1978 在人类脐带血中发觉存在造血干细胞1981 Evans和Kaufman建立小鼠胚胎干细胞系1997 白血病起源于造血干细胞发觉证实了肿瘤干细胞存在1998 Thomson等建立第一个人胚胎干细胞系1996 克隆羊D

3、olly诞生s 很多报道表明成体干细胞含有可塑性 美国Advanced Cell Technology企业科学家首次采取克隆技术培育出人类早期胚胎（6个分裂球）- 韩国研究者黄禹锡(Hwang Woo-suk)声称利用体细胞核转移技术培育出几个人类胚胎干细胞系，以后被证实是伪造 英国科学家用脐带血干细胞分化出第一个人造肝细胞6干细胞专题知识讲座第6页干细胞起源和进展.1 科学家发觉在羊水中存在一个新型干细胞，它能够在研究与治疗中替换胚胎干细胞.6 3个研究小组同时报道发觉小鼠正常皮肤细胞能够重新编程成为干细胞；同时科学家Shoukhrat Mitalipov首次报道经过体细胞核转移技术制备猴胚

4、胎干细胞成功.10 Mario Capecchi, Martin Evans和Oliver Smithies分获诺贝尔生理和医学奖，奖励他们在胚胎干细胞和小鼠基因“敲除”方面贡献.11 日本科学家宣告成功把人体皮肤细胞（纤维原细胞）改造成类似胚胎干细胞多潜能干细胞诱导性多潜能干细胞.1 不需要破坏胚胎即可制备人类胚胎干细胞系（Advanced Cell Technology）.1 美国科学家利用人成纤维细胞核进行体细胞核转移技术取得了人类胚泡（囊胚）.3 自体间充质干细胞成功治疗关节变性病 .10 德国科学家成功把人类睾丸细胞改造成多潜能干细胞，美国科学家将人类发根角化细胞转化为类胚胎干细胞7

5、干细胞专题知识讲座第7页干细胞生物学特点属低分化细胞，缺乏分化标识；在机体数目和位置相对恒定；含有自我更新能力；含有多向分化潜能，即含有分化发育可塑性，其分化受所处周围微环境（niche）影响；能无限地分裂、增殖；分裂慢周期性，绝大多数干细胞处于G0期；两种生长方式：一是对称分裂，形成两个相同干细胞；二是不对称分裂，一个子代细胞保持干细胞特征，另一个成为祖细胞，最终分化成终末细胞。8干细胞专题知识讲座第8页干细胞生长分裂方式9干细胞专题知识讲座第9页干细胞分类依据发生学起源分类胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs） 是指由胚胎内细胞团（inner cell mass

6、,ICM）经体外抑制培养，在传代过程中筛选出含有多能性细胞。成体干细胞（Adult stem cells） 是指存在于一个已经分化组织未分化细胞，这种细胞能够自我更新而且能够特化形成组成该类型组织细胞。比如：造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、皮肤表皮干细胞、胰腺干细胞等。10干细胞专题知识讲座第10页人类胚泡形成 11干细胞专题知识讲座第11页原肠胚期发育成3个胚层，外胚层、中胚层和内胚层： 外胚层发育成神经系统、皮肤、指甲、鼻、口、肛门、眼球晶状体和视网膜。 中胚层发育成身体排泄系统，循环系统和运动系统。 内胚层发育成内消化道，呼吸道等。 人类组织分化 12干细胞专题知识讲

7、座第12页13干细胞专题知识讲座第13页14胚胎干细胞又称全能干细胞它是从胚胎细胞团中分离出来、能在体外培养一个高度未分化细胞,是一个含有全能性或多向性分化潜能细胞。其特点是能大量繁殖并保持未分化状态;在一定条件下能向内、中、外3 个胚层组织和细胞分化;易于进行基因改造操作,注入囊胚后能广泛参加宿主胚胎各组织器官生长发育,形成嵌合体;在体外培养扩增时,经遗传操作、选择和冻存,均不失其全能性;在不一样生长条件下含有不一样功效状态。干细胞专题知识讲座第14页成体干细胞横向分化普遍性预测并说明横向分化机制,就有可能利用病人本身健康组织干细胞诱导分化成病损组织功效来治疗疾病。这么既可处理免疫排斥问题,

8、又可防止胚胎细胞起源不足和社会伦理问题。当前研究成体干细胞主要有造血干细胞、角膜缘干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞和胰腺干细胞等。干细胞专题知识讲座第15页特征胚胎干细胞(hESCs)成体干细胞分化潜能多潜能（Pluripotent）干细胞可诱导分化成为三个胚层中全部种类细胞分化潜能多样，主要为多能（ multipotent）干细胞起源和分离方法体外受精剩下胚胎或用体外核转移技术(SCNT)取得胚胎，但SCNT成功率极低，费用昂贵。技术要求高即使数目有限，个体特异性成体干细胞较轻易取得。需要外科方法介入来分离组织 (入骨髓穿刺、鼻粘膜活检等）。细胞分离技术要求不高伦 理主要问题在于分

9、离胚胎干细胞会破坏胚胎，利用体外核转移技术对人类克隆存在争论该方面问题较少，主要是提取成体干细胞要取得捐助者知情同意，分离细胞是否能够进行买卖等体外培养与保留在体外细胞培养时能够自我更新，能够在体外进行长久培养，并能够冻融。但体外培养需要维持其稳定性（不分化），长时间培养可能出现遗传不稳定性在体外培养极难生长，在体外环境中不能自我更新免疫原性个体特异性 hESCs (体外核转移技术) 在细胞治疗中免疫性低来自自体干细胞治疗不会产生免疫反应肿瘤形成肿瘤形成率高，干细胞治疗遗传不稳定性肿瘤形成率相对较低细胞遗传修饰轻易进行遗传改造，细胞能够进行体外挑选，但也能够产生不需要突变遗传改造较难（因为细胞

10、数量少，而且难于培养），可采取细胞融合进行基因治疗。疾病传输风险有病毒感染风险（来自喂养细胞和血清），需建立不依赖喂养细胞、不依赖血清生长胚胎细胞系异体移植需考虑配型治 疗当前尚无人体治疗和临床研究报道已用于临床治疗（如治疗白血病和淋巴瘤）16干细胞专题知识讲座第16页依据分化潜能分类全能干细胞（Totipotent stem cell）多潜能干细胞（Pluripotent stem cell）多能干细胞（Multipotent stem cells）单能干细胞（Unipotent stem cell）17干细胞专题知识讲座第17页全能（Totipotent）干细胞是指含有没有限分化潜能，能分

11、化成全部组织和器官干细胞，包含胎盘。其含有发育成完整个体能力。Totipotent cells have the potential to become any type in the adult body any cell of the extraembryonic membranes (e.g., placenta). 18干细胞专题知识讲座第18页多潜能（ Pluripotent）干细胞是含有自我更新能力和高度增殖以及多向分化潜能，并能够定向诱导分化为三个胚层中全部种类细胞，它能够用来形成复杂组织和器官。但与全能干细胞相比，它失去了发育成完整个体能力，发育潜能受到一定限制。自然状态下存在

12、三种多潜能干细胞：胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES）：起源于体外受精胚泡内细胞团；胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EG）：来自胎儿性腺原生殖细胞；胚胎肿瘤细胞（Embryonic Carcinoma Cells, EC）：来自畸胎瘤，但为非整倍体细胞。19干细胞专题知识讲座第19页胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EG） 指来自于5-10周龄胚胎性腺区早期生殖细胞。在发育后期，性腺区发育成睾丸或卵巢，原始生殖细胞（primordial germ cell，PGC）产生精子或卵子。胚胎肿瘤细胞（Embryonic Carci

13、noma Cells, EC） 是起源于恶性畸胎瘤一个多潜能干细胞。畸胎瘤是由机体内幼稚生殖细胞发生变异而形成肿瘤。恶性畸胎瘤内既含有各种各样分化成熟组织，还含有一些未分化、能不停增殖干细胞，因其形态和发育潜能都类似胚胎细胞，而且是恶性，故称其为胚胎肿瘤细胞。20干细胞专题知识讲座第20页Human pluripotent embryonic stem (ES) and embryonic germ (EG) cells21干细胞专题知识讲座第21页ES cell =胚胎干细胞EG cell = 胚胎生殖细胞EC cell = 胚胎肿瘤细胞SSEA = 阶段特异性胚胎抗原TRA = 抑制肿瘤抗

14、原-1LIF = 白血病抑制因子bFGF = 碱性成纤维细胞生长因子EB = 胚体22干细胞专题知识讲座第22页人工方法取得多潜能干细胞：体细胞核移殖技术（Somatic cell nuclear transfer ，SCNT)人工诱导多潜能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPS）23干细胞专题知识讲座第23页多能（Multipotent）干细胞是指能分化成与其起源相近特定组织或器官干细胞（比如造血干细胞能够分化为红血细胞、白血细胞和血小板，肝干细胞能够分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞，神经干细胞能够分化为神经元、神经胶质细胞等）。24干细胞专题知识讲座第2

15、4页Blood Cell Differentiation from Hematopoietic Stem Cells (HSCs).25干细胞专题知识讲座第25页单能（Unipotent）干细胞只能产生一个细胞类型；不过，含有自我更新属性，将其与非干细胞区分开。如肝干细胞、胰腺干细胞、肠上皮干细胞、角膜缘干细胞等。 受损小鼠肝脏内，在肝胆管周围存在FoxL1表示阳性（水蓝色）肝干细胞，它们被肝纤维细胞（品蓝）所包裹，组成了干细胞生存和发挥功效微环境。26干细胞专题知识讲座第26页干细胞自我更新与分化调控内源性调控 细胞内多级水平分子调控 外源性调控（干细胞微环境）细胞因子 细胞间相互作用 细胞

16、外基质 环境理化性质27Wnt 信号通路 TGF- 转化生长因子- bFGF 碱性成纤维细胞生长因子BMP 骨形成蛋白S1P 鞘氨醇-1-磷酸PDGF 血小板起源生长因子BDNF 脑源性神经营养因子 干细胞专题知识讲座第27页内 容第一节 干细胞生物学第二节 干细胞工程原理与技术28干细胞专题知识讲座第28页第二节 干细胞工程原理与技术干细胞起源干细胞分离和培养干细胞定向诱导分化干细胞检测方法29干细胞专题知识讲座第29页干细胞工程细胞治疗（cytotherapy）是应用含有特定功效细胞群或细胞克隆治疗肿瘤、感染、本身免疫性疾病、基因缺点等疾病一个包括生物免疫学和基因学治疗伎俩。第一代细胞治疗

17、：全血输注；第二代细胞治疗：骨髓和外周血干细胞移植；第三代细胞治疗：在分离纯化少许干细胞基础上，经过细胞工程技术，在体外扩增和定向诱导分化，或对其进行基因改造后，将产生大量目标细胞回输体内进行治疗。干细胞工程是利用干细胞增殖特征，多向分化潜能及其增殖分化高度有序性，经过体外培养干细胞、诱导干细胞定向分化，或用转基因技术处理干细胞以改变其特征，以到达利用干细胞为人类服务目标。 30干细胞专题知识讲座第30页干细胞起源干细胞起源：胚胎（体外受精、核移殖技术）、胎儿与新生儿脐带血、成体31干细胞专题知识讲座第31页干细胞分离纯化解离（散）组织制备细胞悬液：机械分离、酶学解离或免疫疗法（immunos

18、urgery）人类胚胎干细胞分离32干细胞专题知识讲座第32页干细胞分离纯化利用细胞体积和密度不一样分离纯化利用细胞对不一样基质粘附性不一样分离细胞Arterioscler Thromb Vasc Biol. ; 28(9):1584-95. 33干细胞专题知识讲座第33页干细胞分离纯化利用细胞表面标志分离纯化 细胞表面标志（cell surface marker）存在于某种细胞表面特异性表面蛋白，利用这些表面蛋白特异性表示，应用抗体结合或其它方法能够检测或取得对应细胞。流式细胞分选术免疫磁珠分选术Identifying Cell Surface Markers Using Fluoresce

19、nt Tags Microscopic Image of Fluorescent-Labeled Stem Cell 34干细胞专题知识讲座第34页未分化造血干细胞表面标识35干细胞专题知识讲座第35页流式细胞术 Fluorescence activated cell sorting, FACS 36干细胞专题知识讲座第36页CD34+ Stem Cells健康人外周血CD34+细胞绝对值（1.060.51）107/L CD34+细胞占白细胞总数（0.160.05）%粒细胞淋巴细胞单核细胞37干细胞专题知识讲座第37页免疫磁珠细胞分选（MACS） 38干细胞专题知识讲座第38页干细胞体外培养胚

20、胎干细胞体外培养条件：质量良好囊胚有效内细胞团分离可靠稳定培养系统有效稳定传代39干细胞专题知识讲座第39页Directed differentiation of mouse embryonic stem cells. 干细胞定向诱导分化干细胞自发分化干细胞定向诱导分化40干细胞专题知识讲座第40页胚体（embryoid body, EB）在体外培养环境中，假如在胚胎干细胞培养体系中撤除抑制细胞分化因子（如喂养细胞或白血病抑制因子LIF等），胚胎干细胞就会失去保持未分化状态能力，能够自发形成多细胞结构，即胚体。胚体中含有3个胚层细胞，胚体继续分化，能够自发分化为血细胞、内皮细胞及神经细胞等不一

21、样类型细胞。体外培养（明胶基质）小鼠胚胎干细胞形成胚体（200）Biochemistry (Mosc). ; 73(13):1438-52. 干细胞自发分化41干细胞专题知识讲座第41页人类胚胎干细胞自发分化 (A)当人类胚胎干细胞移植到免疫缺点小鼠睾丸囊内，免疫组化HE染色显示为经典畸胎瘤：（1）软骨，（2）原始神经细胞，（3）复层扁平上皮，（4）腺上皮，（5）肌肉，及其它细胞。(B)免疫组化显示人类胚胎干细胞胚体。（Scale bars: A, 800 M; B, 100 M）Development 131, 5515-5525 ()42干细胞专题知识讲座第42页干细胞定向诱导分化干细胞定

22、向诱导分化加入生长和分化因子（激活内源性转录因子）干细胞遗传改造（转染外源性转录因子）与特定分化细胞（喂养细胞）共培养43干细胞专题知识讲座第43页J Cell Biochem. ; 105(3): 633640.体外诱导hESC向神经细胞分化生长和分化因子悬浮培养法 附着培养法bFGF44干细胞专题知识讲座第44页Nature Immunology 5, 359 - 360 () 利用OP9 和OP9-DL1细胞作为基质细胞在体外诱导胚胎干细胞分化为T和B淋巴细胞 共培养法45干细胞专题知识讲座第45页胚胎干细胞诱导分化NR, 未报到; BMP,骨形成蛋白; GFs, 生长因子; EGF,表

23、皮生长因子; VEGF,血管内皮生长因子; GDNF,胶质细胞源性神经营养因子; SCF,干细胞因子; GCSF,粒细胞干细胞因子; EB, 胚体; END-2,内脏内胚层样细胞系.Endocrine Reviews ; 27(2):20821946干细胞专题知识讲座第46页干细胞检测方法依据细胞形态检测：如体积小、核浆比大依据生长特征检测：呈克隆状生长；ES细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化扁平状上皮细胞依据特异性细胞表面标识分子检测：流式细胞术，免疫荧光,Werstern blot检测细胞内特异基因表示水平：定量PCR, 基因芯片,Werste

24、rn blot分化潜能检测：体外分化试验；体内分化试验（移殖与重建）核型检测其它：利用干细胞慢周期性，采取标识滞留细胞方法来识别在体内静息干细胞；胚胎干细胞碱性磷酸酶（AKP）染色（未分化为阳性）等47干细胞专题知识讲座第47页Biochemistry (Mosc). ; 73(13):1438-52. 小鼠ES细胞碱性磷酸酶活性检测和SSEA-1抗原免疫荧光分析。 48干细胞专题知识讲座第48页人类胚胎干细胞H1在化学合成培养基中表型分析Proc Natl Acad Sci U S A. ;103(18):6907-12. 49干细胞专题知识讲座第49页人类胚胎干细胞H1在体内和体外分化能力

25、检测。A为裸鼠体内自发分化；B和C为体外诱导形成神经细胞。a.腺泡b.成骨细胞c.神经上皮细胞d.视网膜色素上皮细胞 e.腺上皮细胞f.柱状上皮细胞Proc Natl Acad Sci U S A. ;103(18):6907-12. 50干细胞专题知识讲座第50页51干细胞专题知识讲座第51页干细胞生物工程及其意义干细胞生物工程是指在体外对干细胞进行操作,包含体外增殖,定向诱导,横向分化,基因修饰和组织成形等。干细胞生物工程科学价值在于其诱人应用前景,用细胞技术治疗疾病将是未来医学发展方向已从干细胞中培养出血液、内皮、心肌、骨、软骨、肌腱、神经细胞等。干细胞专题知识讲座第52页特异性分化细胞系建立胚胎干细胞可形成生物个体全部组织细胞。大家正致力于人类胚胎干细胞识别、分离、体外培养扩增与分化诱导工作。当前研究表明,人类胚胎干细胞可在体外诱导为造血干细胞、神经干细胞和心肌干细胞等。干细胞专题知识讲座第53页组织和器官培养在适当控制条件下,胚胎干细