dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离

1、dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第1页二、方法与过程 1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀取得）0.1g/mL柠檬酸钠100mL活鸡鲜血180mL500mL烧杯中，玻棒搅拌，离心、分离或静置沉淀。2.提取DNA。取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌。纱布过滤：滤液中含DNA和其它核物质，如蛋白质。原理：血细胞细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌，机械加速血细胞破裂。.提取血细胞核物质：.溶解核内DNA： 滤液2mol/LNaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓搅拌。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第2

2、页.析出含DNA粘稠物：.滤取含DNA粘稠物：. DNA粘稠物再溶解： 在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停顿加水（此时NaCl溶液浓度相当于0.14mol/L）。 用多层纱布过滤，含DNA粘稠物留在纱布上。 20mL2mol/LNaCl溶液步骤含DNA粘稠物在20mL烧杯中轻缓搅拌3min，使尽可能多DNA溶解在NaCl溶液。.过滤含有DNANaCl溶液： 用放有两层纱布漏斗过滤步骤所得溶液，滤液中含有DNA。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第3页.提取含有杂质较少DNA： 步骤所得滤液体积分数为95%冷却酒精50mL，用玻棒沿一个

3、方向轻缓搅拌，溶液中（析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸收上面水分。3.DNA判定： 加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”三、试验小结dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第4页四、试验原理拓展介绍。1.DNA释放。 DNA主要在鸡血细胞细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一个低渗液，水分能够大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌机械作用，加速血细胞细胞膜和核膜破裂。但释放出来大量DNA与RNA、蛋白质

4、结合在一起，即释放不是纯净DNA，常称为DNA核蛋白。2.DNA与蛋白质分离。 在高浓度（2mol/L）氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，析出DNA并溶解在高浓度氯化钠溶液中3.DNA析出与获取。 因为DNA在低浓度（ 0.14mol/L ）氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质在其中溶解度大。所以在向含DNA高浓度氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第5页4.DNA再溶解。用高浓度（2mol/L）氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。5.DNA沉淀和浓缩。 对于除去了蛋白质DNA氯化钠溶液，必须再深入沉淀和浓缩，常见酒精沉

5、淀法。即往含有NaDNA溶液，加入体积分数为95%冷却酒精，混匀后能够使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少DNA丝状物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后DNA丝状物能够用玻棒（玻棒有吸附DNA作用）缓缓旋转方法卷起。6.DNA判定。100DNA二苯胺 蓝色物判定时蓝色深浅与溶液中DNA含量多少相关。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第6页方法步骤 加入物质 目标 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 3.溶解细胞核内DNA 2 m1LNaCI溶液40mL 4.析出含DNA黏稠物 蒸馏水 5.滤取含DNA黏

6、稠物 6.将DNA黏稠物再溶解 2 molLNaCl溶液20 mL 7.过滤含DNANaCl溶液 8.提取含有杂质较少DNA 冷却95酒精50 mL A:(1)向试管中加入0.015 molLNaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺试剂 9.DNA判定 B:(1)向试管中加入0.015molL NaCl溶液5mL (2)4 mL二苯胺试剂 dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第7页加入柠檬酸钠溶液目标是预防血凝固加速血细胞破裂 溶解DNA 使2mol/LNaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大程度地释出 使含DNA黏稠物被留在纱布上使含DNA黏稠物尽可能多溶

7、解于溶液中除去含DNA滤液中杂质提取DNA A出现蓝色 B无改变dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第8页2.试验中NaCl物质量浓度为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?1.在DNA粗提取试验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水作用是( )。A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少DNA答：B答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第9页3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色4.提取鸡血中DN

8、A时，为何要除去血液中上清液?答：DNA提取，关键是对杂质去除，因为上清液是血液中血浆个别，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。答：Ddna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第10页(一) PCR原理体内DNA复制:模板DNA原料: dNTP酶: 解旋酶、DNA pol. 起始引物、合成方向合成环境dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第11页解链模板变性引物-起始引物-模板复性子链延伸子链延伸(一) PCR原理dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第12页结果分析与评价此为紫外光吸收检测结果检验法，实践中极少用；普遍采取琼脂糖凝胶电泳法检验PCR结果dna的粗提取与鉴

9、定pcr蛋白质的提取与分离第13页Fig. 7.23DenatureAnneal PCR PrimersExtend PCR Primersw/TaqRepeatdna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第14页多聚酶链式反应（PCR） 扩增DNA片段 dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第15页一、试验目标 了解PCR基础原理，学习PCR基础操作技术。 dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第16页二、试验原理 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， 简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段一个方法。经典PCR由高温变性、低温退火和适温延伸三步反

10、应组成一个循环周期，经过屡次循环反应，使目标DNA得以快速扩增。其原理以下：将待扩增DNA置于高温下使之解链，人工合成两个寡核苷酸引物在低温下分别与目标片段两侧两条链互补结合；DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板53端方向延伸，合成DNA新互补链。重复进行这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围内DNA序列以指数形式扩增。循环次数主要取决于模板浓度，从理论上讲一个模板DNA分子经20次循环扩增后可达106。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第17页PCR基础原理 变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物 PCR三步曲变性 9097退火 4565延伸 7

11、2左右PCR过程dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第18页(二) PCR反应过程变性-复性-延伸多重循环(n)模板以2En扩增短片段以指数式扩增长片段以线性式扩增最终主产物片段长度在P1-P2之间dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第19页PCR技术广泛应用于分子生物学等各个领域。它既可用于基因分离、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突变体和重组体构建、基因表示调控和研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊疗、肿瘤机制探索及医学判定等多方面，也被广泛利用于刑侦物证判定、亲子判定及古分子系统学研究等其它领域。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第20页高中生物技术实践课件血红

12、蛋白提取和分离dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第21页 本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子基础过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子基础原理。1、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白提取中分别起到什么作用。2.主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质原理 电泳法分离样品原理 缓冲溶液组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法原理和方法 4、课题难点：样品预处理 色谱柱填料处理和色谱柱装填。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第22页 年4月14日宣告人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：指DNA分子所携带全部遗传信息

13、 蛋白质组：生物个体表示蛋白质分子总和。主要是对蛋白质功效研究dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第23页血液血浆水 分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细 胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90）两个肽链两个一肽链四个亚铁红素基团2.提问：血液有哪些成份？ 1.提问：用鸡红细胞提取DNA，用人红细胞提取血红蛋白原因是什么？ 鸡红细胞含有细胞核，含有DNA，便于进行DNA提取；人红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第24页血红蛋白两个肽链两个一肽链四个亚铁红素基团每个肽链围绕一个亚铁血红素基团，

14、此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白特点：dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第25页1.分离生物大分子基础思绪： 选取一定物理或化学方法分离含有不一样物理或化学性质生物大分子。2.蛋白质分离和提取原理： 依据蛋白质各种特征差异，如分子形状和大小、所带电荷性质和多少、溶解度、吸附性质和对其它分子亲和力等等，能够用来分离不一样种类蛋白质。 一、血红蛋白提取和分离3.高温灭菌和酒精灭菌结果： 使微生物蛋白质发生变性、蛋白质空间结构被破坏。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第26页（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖

15、类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）组成多孔小球体，内部有许多贯通通道。 依据被分离物质蛋白质相对分子质量大 小，利用含有网状结构凝胶分子筛作用，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法原理分子筛效应： 当相对分子量不一样蛋白质经过凝胶时，相对分子量较小蛋白质轻易进入凝胶内部通道，旅程较长，移动速度较慢;而相对分子量较大蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，旅程较短，移动速度较快。相对分子质量不一样蛋白质分子所以得以分离。依据特征是：蛋白质分子量大小。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第27页4.凝胶色谱法分离蛋白质原理和详细过程dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第28页 （

16、二）缓冲溶液 1.概念: 在一定范围内，凡是能够抵制外加少许强酸或强碱影响使原来溶液PH值基础保持不变混合溶液。 能够抵制外界酸和碱对溶液PH值影响，维持PH基础不变。2.作用:3.缓冲溶液配制: 通常由12 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调整缓冲剂使用百分比就能够制得在不一样PH范围内使用缓冲液。 4.提问：在本课题中使用缓冲液是:_ ,其目标是: 利用缓冲液模拟细胞内PH环境，确保 血红蛋白正常结构和功效，便于观察(红色)和科 学研究(活性)磷酸缓冲液dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第29页 缓冲溶液组成及分类弱酸及其对应盐：弱碱及其对应盐：多元弱酸酸式盐及其对应次级盐:H2CO

17、3NaHCO3 ；CH3COOHCH3COONaNH3H2ONH4CL ; NH4OHNH4CLNaHCO3Na2CO3 ；NaH2PO4Na2HPO4 缓冲溶液由足够浓度共轭酸碱对组成。其中，能反抗外来强碱称为共轭酸；能反抗外来强酸称为共轭碱。这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见缓冲对主要有以下三种类型：dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第30页 （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移过程。2.原理： 许多主要生物大分子，如多肽、核酸等都含有可解离基团，在一定PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极移动。电泳利

18、用了待分离样品中各种分子带电性质差异以及分子本身大小，形状不一样，使带电分子产生不一样迁移速度，从而实现样品中各种分子分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第31页 在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第32页 聚丙稀酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常见十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂作用下聚合交联成含有三维网状结构凝胶。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与

19、分离第33页 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率取决于它所带净电荷多少以及分子大小等原因。 （SDS作用）为了消除净电荷对迁移率影响，能够在凝胶中加入SDS。2.原理： 聚丙稀酰胺凝胶电泳 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成蛋白质复合体在SDS作用下会解聚成单条肽链，所以测定结果只是单条肽链分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷量大大超出了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不一样种蛋白质间电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子大小。3. SDS作用机理:dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第34页用SDS测定蛋白质分子量方法 使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

20、测定蛋白质分子量时，可选取一组已知分子量标准蛋白同时进行电泳，依据已知分子量标准蛋白电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量对数作标准曲线，能够测定未知蛋白质分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量标准蛋白试剂出售。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第35页 二、试验操作样品处理粗分离纯化纯度判定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程 本课题可选取猪、牛、羊或其它脊椎 动物血液来分离血红蛋白。(1)红细胞洗涤:洗涤目标: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一

21、同沉淀，达不到分离效果）3、吸收血浆：上层透明黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积质量分数为0.9氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤洁净。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第36页(2)血红蛋白释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40体积甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液： 过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以r/min速度离心10 min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（

22、中下层）：血红蛋白水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层红色透明液体。 二、试验操作dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第37页甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第38页(4)透析： 过程：取1ml血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml物质量浓度为20mmol/l磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。透析目标：除去样品中分子量较小杂质。 二、试验操作dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取

23、与分离第39页2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱制作： 取长40厘米，内径1.6厘米玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管一端。注意事项：底塞中插入玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然难以铺实尼龙网，还会造成液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按对应位置组装成一个整体。安装其它从属结构。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第40页 （2）凝胶色谱柱装填 凝胶选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶得水值，即每

24、克凝胶膨胀时吸水7.5克。 凝胶前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽可能紧密，以降低凝胶颗粒之间空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第41页 洗涤平衡：装填完成后，马上用缓冲液洗脱瓶，在50cm高操作压下，用300ml20mmol/l磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时

25、。注意：1、液面不要低于凝胶表面，不然可能有气泡混入，影响液体在柱内流动与最终生物大分子物质分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒现象。 （2）凝胶色谱柱装填50cm高dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第42页（3）样品加入与洗脱 调整缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液迟缓下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁围绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗透凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗透凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：小心加入pH=7.0 20mmol/l磷酸缓冲液到适当高度

26、，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 搜集：待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每5ml搜集一试管，连续搜集。（在分离过程中，假如红色区带均匀一致移动，说明色谱柱制作成功） 注意：正确加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第43页（3）样品加入与洗脱注意：正确加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第44页思索下面问题：让血红蛋白处于稳定pH范围内，维持结构和功效。 1、在血红蛋白整个过程中不停用磷酸缓冲液

27、处理目标是什么？ 2、与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，所以在凝胶色谱分离时能够经过观察颜色来判断什么时候应该搜集洗脱液。这使血红蛋白分离过程非常直观，大大简化了试验操作。 3、你能描述血红蛋白分离完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离程序可分为四大步，包含：样品处理、粗分离、纯化和纯度判定。首先经过洗涤红细胞、血红蛋白释放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，即:样品处理；再经过透析去除分子量较小杂质，即样品粗分离；然后经过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即:样品纯化；最终经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度判定。dna的粗提取与鉴定p

28、cr蛋白质的提取与分离第45页（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2.试剂配制：判定血红蛋白纯度。1.目标： 丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺: 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）丙烯酰胺和1%N, N-甲叉双丙烯酰胺贮存液。十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成10%贮存液，于室温保留。用于制备分离胶和浓缩胶Tris缓冲液。TEMED ：作用经过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合。用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需自由基。此溶液须配制新鲜液。Tris甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/

29、L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%SDS。样品处理液： 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%巯基乙醇，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。染色液： 0.1%考马斯亮蓝R250，40%甲醇，10%冰醋酸。脱色液：10%甲醇和10%冰醋酸。dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第46页 1、因为制备凝胶丙烯酰胺和双丙烯酰胺含有很强神经毒性，而且轻易被皮肤吸收，所以操作必须在通风橱内或通风处进行。 2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大破坏作用，吞服可致命。 3、在进行电泳操作时一定按照试验要求

30、和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳dna的粗提取与鉴定pcr蛋白质的提取与分离第47页 SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6 mL，30%丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8Tris缓冲液2.5 mL，10%SDS 0.1 mL，10%过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，快速灌注在两玻璃板间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL，30%丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8Tris缓冲液0.5 mL，10%SDS0.041 mL，10%过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合分离胶上