肉毒梭菌及肉毒毒素检验

1、肉毒梭菌及肉毒毒素检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验第1页肉毒梭菌食物中毒与肉毒梭菌及芽胞无直接关系，是肉毒素进入血循环后，选择性作用于运动神经与副交感神经，主要作用点是为神经末梢，抑制神经传导介质乙酰胆碱释放，因而引发肌肉运动障碍，发生软瘫。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第2页（一）形态及染色肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，是革兰氏阳性粗大杆菌，其大小为（4-6）m（0.9-1.2） m ，两端钝圆，普通单个存在，偶有成对或成短链状，无荚膜。周身有48根周毛，能运动。芽胞呈卵圆形，大于菌体，位于菌体次末端，使细菌呈匙形或网球拍状。在老龄培养物上呈革兰氏阴性。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第3页（二）生长要求和培养

2、特征肉毒梭菌为专性厌氧菌，可在普通培养基上生长。28-37生长良好，但本菌产生毒素最适生长温度为25-30，最适pH为6-8（细菌在8以上，pH 4以上都可形成毒素），在10食盐溶液中不生长。在固体培养基上，形成不规则直径约3mm圆形菌落，菌落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界限不显著，有向外扩散现象，常扩展成菌苔。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第4页在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小、扁平、颗粒状、中央低隆、边缘不规则、带丝状或绒毛状菌落。开始较小，37培养3d-4d，可达5mm-10mm，通常不易取得良好菌落，因易于汇合在一起，有菌落有大溶血环。在卵黄琼脂生长后，菌落及其周围培养基表面覆盖着特有彩

3、虹样（或珍珠层样）薄层，但G型没有。在含有肉渣液体或半流动培养基中，肉毒梭菌生长旺盛而且产大量气体。A、B、F三型表面浑浊，底有粉状或颗粒状沉淀，并能消化肉块，变黑有臭味。而C、D、E三型则表现清亮，絮片状生长，粘贴于管壁。 肉毒梭菌及肉毒毒素检验第5页（三）毒素及其类型依据肉毒梭菌能产毒素抗原特异性可分为A、B、C、D、E、F、G七型，其中C型又分为C型和C型。各型毒素，只为其对应抗毒素所中和（即A型毒素只为A型抗毒素所中和，等等），但C型毒素既可为C型抗毒素又可为C型抗毒素中和。依据肉毒梭菌生化反应亦可分为两型：一个能水解凝固蛋白称为解蛋白菌；另一个不能水解凝固蛋白，称为非解蛋白菌。前者能

4、产生A、B、C、D、E、F、G型毒素，后者能产生B、C、D、E、F型毒素。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第6页型别毒素起源主要易感动物所致疾病抗毒素A发酵食品、罐头食品人、鸡、牛、马、水貂人食物中毒，鸡软颈病，牛，马水貂中毒特异性B发酵食品、肉制品人、牛、马、水貂、鸡人食物中毒，牛，马水貂中毒，鸡软颈病特异性C灰绿蝇、蛆、池沼腐烂植物水禽禽类软颈病可中和C和C毒素C含毒素饲料、腐尸牛、羊、马、水貂牛、羊、马、水貂中毒可中和C和C毒素D腐肉牛非洲牛跛病特异性E生鱼、海生哺乳动物人食物中毒特异性F发酵食品、肉品人食物中毒特异性G食物中毒特异性肉毒梭菌及肉毒毒素检验第7页（四）生化特征肉毒梭菌能分解葡萄糖、

5、麦芽糖及果糖，产酸产气，对其它糖分解作用因菌株不一样而异。能液化明胶，但菌株间有液化能力差异。迟缓液化凝固血清3715d，使牛乳消化，产生H2S，但不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第8页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第9页（五）抵抗力肉毒梭菌毒素为一个蛋白质，相对分子质量1500000，通常以毒素分子和一个血细胞凝集素载体（相对分子质量为500000）所组成复合物形式存在，不被胃液或消化酶所破坏，在pH3-6范围内毒性不减弱，但在pH8.5以上或100l0min-20min常被破坏。毒素在干燥密封和阴暗条件下，可保留多年。毒素用甲醛处理后即变为类毒素。毒素及类毒素都有抗原性，注射于动

6、物体内能产生抗毒素。肉毒梭菌加热至8030min或10010min即可杀死，但其芽胞抵抗力强，煮沸要6h、1052h、11036min、1204min-5min才能将其杀死。肉毒梭菌全部菌株在45以上都受到抑制。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第10页（六）致病性肉毒梭菌致病物质基础，是它产生强烈外毒素肉毒素，是当前所知最强烈细菌外毒素。提纯外毒素1mg含有三亿个小白鼠半数致病量，毒素作用于神经系统，引发运动神经麻痹而致病。引发人类食物中毒主要为A、B、E三型（见表630所致疾病一栏），F型亦可引发人类毒血症，E型肉毒素，可被胰酶激活而毒力增强。人工感染细菌全培养物、细菌滤液、含毒素送检材料，均可使小白

7、鼠或脉鼠发病死亡，兔、猫、犬易感性较低。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第11页七）肉毒中毒1、流行病学肉毒梭菌食物中毒又叫做肉毒中毒，是因为大家因误食了被肉毒梭菌污染，并在其中繁殖过程中所产生外毒素所致。引发肉毒中毒食品，因饮食习惯和膳食结构不一样而有差异。日本发生肉毒素主要由鱼类、鱼卵等水产品所引发。其中家庭自制食品引发者占93，市售食品引发者占5.4。美国发生肉毒中毒主要由家庭自制蔬菜、水果罐头、水产品和肉、奶类制品所引发。其中家庭自制食品占72，市售商品引发者占9.0。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第12页我国发生肉毒中毒，91.48由植物性食品所引发，8.52由动物性食品所引发。在植物性食品中，绝大个

8、别是家庭自制发酵食品，比如臭豆腐、豆豉、豆酱和制造面酱一个中间产物，即“米送糊糊”等。这些发酵食品所用原料粮和豆类常带有肉毒梭菌，发酵过程往往在密闭容器中和高温环境下进行。因为加热时间短，未能杀灭肉毒梭菌芽胞，又在20-30进行发酵，所认为芽胞生长繁殖并产生毒素提供了适宜条件，如食品不经加热，即可引发中毒。肉类及其制品等动物性食品，在贮存过程中如被肉毒梭菌所污染，在较高室温下数日，肉毒梭菌即可繁殖并产生毒素，带有毒素食品如食前未经加热或加热不彻底，即引发中毒。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第13页2、临床症状肉毒中毒潜伏期短者仅2h，长者可达10d左右通常约12h-18h，其特点是潜伏期愈短，死亡率也

9、就愈高，说明其毒素含量高、毒力强。本病症状比较严重，主要为神经出现麻痹，患者眼睑下垂，出现复视，继而为运动困难，不能抬头，头多倒向一侧或向前，肌肉无力，吞咽和语言都困难，口腔分泌物多，但无法咽下，所以渴感增加，瞳孔放大，对光反射迟钝，还可见有斜视，普通神志仍清楚，后期还发生呼吸困难。患者普通无显著体温改变或稍低于正常，胃肠道无显著症状，但也有少数病例，在发病早期出现胃肠炎，而后出现经典神经症状。病程约2d-3d，有些病例可连续2周-3周。不少患者在病后期，可能出现便秘和鼓肠，死亡率可达30-60以上。死亡原因主要是呼吸困难（麻痹）所致，直到死前神智仍清楚，保持知觉，患者有恐惧感。肉毒中毒愈后普

10、通无后遗症，但一些症状消失迟缓，最终能够恢复正常。也有极别病例，可能在较长时期内一直存在某肢体不完全瘫痪情况。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第14页3、预防和治疗（1） 预防肉毒中毒发生，普通有以下几个情况：即制作食品原料中带有肉毒梭菌芽胞，在食品加工过程中，芽胞未被全部杀灭，在食品加工或贮存过程中，温度较高，缺氧，适宜芽胞繁殖和产毒；熟食品在食用前未经充分加热使毒素完全破坏。所以，为预防本病发生可采取以下办法：食品制造前应对食品原料进行清洁处理，除去泥土和粪便，用优质饮用水充分清洗。尤其在肉毒中毒多发地域，土壤及动物粪便带菌率较高，故要求更应严格。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第15页罐头食品生产，除建立严

11、密合理工艺规程和卫生制度预防污染外，并应严格执行灭菌操作规程。罐头在贮藏过程发生胖听或破裂时，不能食用。制作发酵食品时，在进行发酵前对粮、谷、豆类等原料应进行彻底蒸煮，以杀灭肉毒梭菌芽胞。加工后肉、鱼类制品，应防止再污染和在较高温度下堆放，或在缺氧条件下保留。盐腌或熏制肉类或鱼类时，原料应新鲜并清洗；加工后，食用前不再经加热处理食品，更应认真预防污染和彻底冷却。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第16页肉毒梭菌毒素不耐热，加热80经30min或100经30min可使各型毒素破坏，故对可疑食品进行彻底加热是破坏毒素预防肉毒中毒可靠办法。预防婴儿肉毒中毒，应首先防止不洁之物进入口内。凡能进入婴儿口中东西（如手

12、指、乳头、玩具等）要注意清洁，以免经口感染。对婴儿补充食品如水果、蔬菜等应去皮或洗净消毒，不可食用变质剩奶或蜂蜜。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第17页（2）治疗抗毒素治疗多价肉毒抗毒血清对本病有特效，必须及早给予。在发病后24h内或瘫痪现象发生前注入最为有效，静脉或肌肉注入（5-10）万IU一次，必要时6h后重复给予同量。支持及对症治疗发病早期确诊为肉毒中毒或疑为本病时，应马上用水或高锰酸钾（1：4000）洗胃并灌肠。病入应平静休息，注意保暖。咽喉部有分泌物积聚时用吸引器吸出。呼吸困难者给氧，必要时进行人工呼吸。吞咽困难者用鼻饲或静脉滴注葡萄糖盐水，发生肺炎等继发感染时给与适宜抗菌药品。伤口染菌所致

13、肉毒中毒患者必须彻底清创，并给予抗毒血清。国外资料表明，盐酸胍有促进末梢神经纤维释放乙酰胆碱作用，故能够治疗 肉毒中毒，约有半数可获助益，但对严重呼吸衰竭者无效。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第18页（八）检验程序GB/T 4789.12-肉毒梭菌及肉毒毒素检验第19页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第20页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第21页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第22页5. 检验程序肉毒梭菌及肉毒毒素检验第23页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第24页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第25页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第26页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第27页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第28页第六章 其它微生物指标测定第一节 食品中酵母和霉菌菌数

14、测定 霉菌和酵母菌广布于外界环境中，它们在食品上能够作为正常菌相一个别，或者作为空气传输性污染物，在消毒不适当设备上也可被发觉。各类食品和粮食因为遭受霉菌和酵母菌侵染，经常发生霉坏变质，有些霉菌有毒代谢产物引发各种急性和慢性中毒，尤其是有些霉菌毒素含有强烈致癌性。实践证实，一次大量食入或长久少许食入，能诱发癌症。当前，已知产毒霉菌如青霉、曲霉和镰刀菌在自然界分布较广，对食品侵染机会也较多，所以，对食品加强霉菌检验，在食品卫生学上含有主要意义。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第29页酵母菌和霉菌能经过以下方式而引发问题：合成毒性代谢产物；能抵抗热、冰冻、抗菌素或射线照射；酵母菌和霉菌能够转换其它对细菌不利

15、物质，而促进细菌生长。它们能够利用果胶和其它碳水化合物、有机酸、蛋白质和脂类这么一些化合物，使食物表面失去色、香、昧。普通不认为酵母菌是蛋白质分解性微生物，多年来研究指出，有一些酵母菌能分解广谱蛋白质物质。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第30页一、原理霉菌和酵母菌菌数测定是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含霉菌和酵母菌菌落数（粮食样品是指1g粮食表面霉菌总数）。霉菌和酵母菌数主要作为判定食品被霉菌和酵母菌污染程度标志，方便对食品卫生情况进行评价。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第31页二、检验程序GB 4789.15-霉菌和酵母计数肉毒梭菌及肉毒毒素检验第32页肉毒梭菌及肉毒毒素

16、检验第33页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第34页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第35页5.2 培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，20摄氏度培养5天，观察并统计。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第36页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第37页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第38页常见产毒霉菌判定肉毒梭菌及肉毒毒素检验第39页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第40页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第41页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第42页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第43页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第44页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第45页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第46页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第47页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第48页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第49页肉毒梭菌及肉毒毒素检

17、验第50页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第51页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第52页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第53页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第54页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第55页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第56页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第57页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第58页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第59页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第60页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第61页肉毒梭菌及肉毒毒素检验第62页第二节 罐头食品商业无菌检验 罐藏食品因保质期长、营养丰富、安全性高而倍受消费者喜爱。罐藏食品是将食品原料经过预处理，装入容器，经杀菌，密封之后制成，通常称之为罐头。罐头密封是为了预防外界微生物侵入，而加热杀菌是要杀死存在于罐内致

18、病菌、产毒菌和腐败菌。合格罐头，因罐内保持一定真空度，罐盖和罐底是平或向内凹陷。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第63页按其pH不一样可分为低酸性罐头、中酸性罐头、酸性罐头和高酸性罐头。以动物性食品原料为主要成份罐头属低酸性，它们富含有大量蛋白质。以植物性食品原料(水果、蔬菜)为主要成份罐头属中酸性或高酸性，主要富含碳水化合物等。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第64页一、罐藏饰品常见专业术语罐头食品商业无菌：罐头食品经过适度杀菌后，不含有致病微生物，也不含有通常温度下能在其中繁殖非致病性微生物状态。密封：食品容器经密闭后能阻止微生物进入状态。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第65页胖听：因为罐头内微生物活动或者化学作用产

19、生气体，形成正压，使一端或两端外凸现象。泄漏：罐头密封结构有缺点，或因为撞击而破坏，或罐壁腐蚀而穿孔致使微生物入侵现象。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第66页低酸性罐头食品：除酒精之外，凡杀菌后平衡pH大于4.6，水活性值大于0.85罐头。酸性罐头食品：杀菌后平衡pH等于或小于4.6罐头食品。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第67页 二、罐头腐败变质原因罐头腐败变质原因有化学原因，如中酸性罐头容器马口铁与内容物相作用引发氢膨胀；物理原因，如贮存温度过高，排气不良，金属容器腐蚀穿孔等；更主要引发腐败原因是罐内污染了微生物而造成腐败变质。这些微生物污染起源有两种情况： 肉毒梭菌及肉毒毒素检验第68页(一)杀菌后罐内

20、残菌有微生物罐头杀菌要考虑罐内食品营养性质，因为商业灭菌只强调杀死病原菌、产毒菌，并没有到达完全无菌状态。罐内可能有一些非致病微生物存在，这些微生物在罐内特殊环境下，一定保留期限内，普通不会生长繁殖，不过假如罐内条件有改变，这个别微生物就会生长繁殖而造成罐头腐败变质。经高压蒸汽杀菌后罐头内残留微生物大多是耐热性芽胞细菌。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第69页 (二)杀菌后发生漏罐因为罐头密封性能不好，杀菌后发生漏罐而造成微生物污染。经过漏罐而造成污染主要污染源是冷却水。罐头在热处理后要经过冷却水进行冷却，冷却水中微生物就有可能经过漏罐处进入罐内。空气也是造成漏罐污染污染源，但不占主要地位。经过漏罐处污

21、染微生物种类很多，包含耐热菌和其它各类细菌。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第70页二、罐藏食品腐败类型罐头因为微生物作用而造成腐败变质，可分为嗜热芽胞细菌、中温芽胞细菌、不产芽胞细菌、酵母菌、霉菌等引发腐败变质。 (一)嗜热芽胞细菌引发腐败变质发生这类变质大多数是因为杀菌温度不够而造成。通常发生三种类型腐败变质现象。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第71页 1、平酸腐败平酸腐败也叫平盖酸败。变质罐头外观正常，内容物却在细菌活动之下变质，呈轻重不一样酸味，pH值可下降0.1-0.3。造成平酸腐败微生物习惯上称平酸菌，大多数是兼性厌氧菌。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第72页比如嗜热脂肪芽胞杆菌，该菌耐热性很强，能在49-

22、55温度中生长，最高生长温度在65，普通pH6.8-7.2条件下生长良好，当pH值靠近5时不能生长，所以，这种菌只能在pH5以上罐头中生长；肉毒梭菌及肉毒毒素检验第73页另一类细菌是凝结芽胞杆菌，它是肉类和蔬菜罐头腐败变质常见菌，它最高生长温度是54-60，该菌突出特点是能在pH4.0或酸性更低介质中生长，所以又称为嗜热酸芽胞杆菌，在酸性罐头，如番茄汁或番茄酱罐头腐败变质时常见此菌。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第74页平酸腐败无法经过不开罐检验发觉，必须经过开罐检验或细菌分离培养才能确定。平酸菌在自然界分布很广，糖、面粉、香辛料等辅料经常是平酸菌污染起源。平酸菌中除有专性嗜热菌外，还有兼性嗜热菌和中

23、温菌。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第75页2、TA菌腐败 TA菌是不产硫化氢嗜热厌氧菌缩写。TA菌是一类能分解糖，专性嗜热，产芽胞厌氧菌，它们在中酸或低酸罐头中生长繁殖后，产生酸和气体，气体主要有二氧化碳和氢气。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第76页假如这种罐头在高温中放置时间太长，气体积累较多，就会使罐头膨胀最终引发破裂。变质罐头通常有酸味。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第77页这类菌中常见有嗜热解糖梭状芽胞杆菌，它适宜生长温度是55，温度低于32时生长迟缓。因为TA菌在琼脂培养基上不易生成菌落，所以通常只采取液体培养法来检验它，比如用肝、玉米、麦芽汁、肝块肉场或乙醇盐酸肉汤等液体培养基，培养温度采取55，检验产

24、气和产酸情况。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第78页 3.硫化物腐败腐败罐头内产生大量黑色硫化物，沉积于罐内壁和食品上，致使罐内食品变黑并产生臭味，罐头外观普通保持正常，或出现隐胀和轻胀，敲击时有浊音。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第79页引发这种腐败变质菌是致黑梭状芽胞杆菌，此菌属厌氧性嗜热芽胞杆菌，生长温度在35-70之间，最适宜生长温度是55，耐热力较前面几个菌弱，分解糖能力也较弱，但能较快地分解硫含氨基酸而产生硫化氢气体。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第80页此菌如在豆类罐头中生长，因为形成硫化氢，开罐时会散发出一个强烈臭鸡蛋味；在玉米、谷类罐头中生长会产生蓝色液体；在鱼类罐头中也常发觉。该菌检验能够经过硫酸

25、亚铁培养基55保温培养来检验，如形成黑斑即证实有此菌存在。罐头污染该菌普通是原料被粪肥污水污染，再加上杀菌不彻底造成。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第81页(二)中温芽胞细菌引发腐败变质中温芽胞细菌最适宜生长温度是37，包含需氧芽胞细菌和厌氧芽胞细菌两大类型。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第82页1、中温需氧芽胞细菌引发腐败变质这类菌耐热性较差，许多细菌芽胞在100或更低一些温度下，短时间就能被杀死，少数种类芽胞耐过高压蒸汽处理而存活下来。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第83页常见引发罐头腐败变质中温芽胞细菌有：枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌等，它们能分解蛋白质和糖类，分解产物主要有酸及其它一些物质，普通不产生气体，少数菌种也产生气体，如多粘芽胞杆菌、浸麻芽胞杆菌等分解糖时除产酸外还有产气，所以前一类群中温芽胞杆菌引发平酸腐败，而后一类群中温芽胞杆菌引发平酸腐败变质时有气体产生。肉毒梭菌及肉毒毒素检验第84页2、中温厌氧梭状芽胞细菌引发腐败变质这类细菌属厌氧菌，最适宜生长温度为37，但许各种类在20或更低一些温度都能生长；还有少许菌种能在50或更高温度中生长。这类菌中有分解糖类丁酸梭菌和巴氏固氯梭状芽胞杆菌，肉毒梭菌及肉毒毒素检验第85页可在酸性或中性罐头内发酵丁酸，产生氢气和二氧化碳，造成罐头膨胀变质。还有一些能分