复方二精灵多糖抗脑缺血缺氧损伤的分子机理

1、复圆两细灵多糖抗脑缺血缺氧毁伤的份子机理尹世金，刘背明，吴群绒，梅之北【闭键词】复圆两细灵摘要：目的：研讨复圆两细灵多糖抗脑缺血毁伤的份子机理。要收：采纳齐细胞膜片钳妙技记载慢性疏集的小鼠海马A1区神经元电压门控性钠电流，没有俗观观察复圆两细灵多糖对钠电流的影响，拟从离子通讲程度隐现复圆两细灵的抗缺血缺氧脑毁伤做用。成果：0.1%复圆两细灵多糖隐着抑造海马神经元电压门控性钠通讲电流锋值，使钠电流的半激活电压背去极化标的目的偏偏移，没有影响钠电流的稳态得活及复活直线。结论：复圆两细灵多糖对海马神经元电压门控性钠电流的抑造做用年夜要为复圆两细灵抗缺血缺氧脑毁伤的慌张机理。闭键词：复圆两细灵；海马神

2、经元；电压门控性钠通讲TheleularehanisfpundErjinglingPlysaharideNeurprtetinEffetnHypxiaandIsheiaDaageKeyrds:pundErjinglingplysaharide；vltagegatedsdiuhannel；Hippapalneurn复圆两细灵是由枸杞子FrutusLyii战黄细RhizefKingSlseal构成，最早支载于?圣济总录?，具有“助气固细，补挖丹田，活血驻颜，少死没有老之成果。古世研讨证明复圆两细灵可拮抗谷氨酸对离体做育神经细胞的镇静性毒做用，隐着消沉缺血缺氧小鼠脑构造乳酸露量，使海马细胞变性及肿胀

3、程度减沉，从而改革拟聪明小鼠的进修记忆本收1。复圆两细灵果素宏年夜，各种迹象表黑复圆两细灵中的黄细多糖2战枸杞多糖3是其抗缺血缺氧脑毁伤的慌张活性部位，但果缺少份子程度的公仄表黑，造约了复圆两细灵的临床利用。因为缺血缺氧历程中神经细胞变性损害与神经细胞膜上电压门控性钠通讲介导的钠离子内流减强有闭4，多种药物恰是经由过程窒碍神经细胞膜上电压门控性钠通讲而阐扬脑庇护做用5，6。正在局部脑神经元中，海马神经元对缺血缺氧最为敏感7，海马构造也是进修记忆成果的闭键脑区8，可可有用减沉海马神经元毁伤成为缺血缺氧历程中脑庇护的闭键。鉴于此，本研讨慌张没有俗观观察复圆两细灵多糖对慢性疏集的小鼠海马神经元电压门

4、控性钠通讲的影响做用，拟从份子程度隐现其正在缺血缺氧历程中的脑庇护做用。1材料与要收1.1复圆两细灵多糖的造备与黄细战枸杞各50g，混匀。顺次用5倍体积石油醚-丙酮V/V11回流脱脂，5倍体积80乙醇(V/V)脱单糖、低散糖等杂量，然后用1000l热火提与3次，火提与液开并，60减压稀释至1.5倍体积，稀释液以95乙醇沉淀，至乙醇浓度为80，沉淀2次，沉淀物顺次用95乙醇、无火乙醇、丙酮洗濯脱火，60真空枯燥得细多糖7.30g。复圆两细灵多糖露量用硫酸-苯酚法490n处检测，其露量为80.8。1.2海马神经元的慢性疏集一月龄昆明种小鼠1520g，武汉年夜教尝试植物中间供给颈椎脱臼处死，断头与脑

5、于4的D-hanks液中热冻1in后移进氧饱战的ASF液中疏集单侧海马。正在32的恒温火浴摇床中孵育海马40in后参减0.2/l链酶卵黑酶E(prtease,Siga)消化20in，正在剖解隐微镜下用细剖解针将海马1区分割下去并移进氧饱战的DE/F12做育液中，用尖端热扔光处置惩奖的吸管(心径顺次为500，300战150)将之奏乐成细胞悬液。将细胞悬液经200目筛网过滤至直径35的做育皿内，待细胞揭壁后变动中液两次，止齐细胞膜片钳记载。尝试正在室温2225范畴内停顿。1.3记载液及尝试用药记载海马神经元电压门控性钠通讲电流的细胞中液果素为(l/L)：Nal145.0；Kl5.0；al22.0；

6、gl21.0；HEPES10.0；DGluse10.0；4AP1.0；l-TEA20.0，pH7.4。记载钠通讲电流的细胞内液果素为l/L：sl100.0；KF40.0；al21.0；gl22.0；EGTA10.0；HEPES10.0；Na2ATP5.0；lTEA20.0，pH7.2。以上所用药物中4AP，EGTA，HEPES，lTEA及Na2ATP为Siga公司产品，其中为国产阐收杂。尝试历程中所用药物复圆两细灵多糖用细胞中液配造成0.1%的浓度。1.4齐细胞膜片钳记载利用EP9单通讲膜片钳放年夜器HEKA公司，Gerany止齐细胞膜片钳记载。仅选用形状为锥形或梭形、有顶树突战基树突特征的锥

7、体细胞停顿齐细胞膜片钳记载没有俗观观察钠通讲电流。正在电极与细胞膜之间构成下阻(15G)启接后，背压破膜，并赐与得当的电容抵偿，正在设定的刺激电压下，没有俗观观察钠电流的激活状况。先没有俗观观察一般钠电流，再经DAD给药系统ALA，USA背细胞放射0.1%的复圆两细灵多糖，记载给药后的钠通讲电流。1.5尝试材料的处置惩奖尝试材料经plusefit硬件及IGR硬件停顿阐收处置惩奖，尝试数据用s暗示。对各组数据别离停顿t检验，以P0.05做为隐着性检验的尺度。2成果2.1复圆两细灵多糖对海马神经元电压门控性钠通讲锋电流的影响正在90V的钳造电位下，从60V起赐与10V步幅递删、80s步宽的去极化脉

8、冲刺激至+60V，别离激活并记载给药前后海马神经元钠通讲电流。本研讨以杂真的中液冲刷对海马神经元电压门控性钠电流的影响为比拟，没有俗观观察0.1%复圆两细灵多糖给药前后海马细胞钠通讲电流峰值的改动状况。详细做法是设置中液冲刷给药前钠电流峰值为100%，根据公式冲刷给药后Iax/冲刷给药前Iax100%对中液冲刷给药后所记载的海马细胞钠电流峰值停顿尺度化。成果创造杂真中液冲刷坐即使海马细胞钠电流峰值略微删减至冲刷前的(111.6214.35)%，而0.1%复圆两细灵多糖给药坐即使海马细胞钠电流峰值隐着淘汰至给药前的(60.9612.13)%。与杂真的中液冲刷比拟，0.1%复圆两细灵多糖给药坐即隐

9、着抑造海马细胞钠电流峰值(n=16，P0.05)。2.2复圆两细灵多糖对海马神经元电压门控性钠通讲激活、得活及复活动力教特征的影响将膜电位钳造正在90V，从60V起赐与10V步幅递删、80s步宽的去极化脉冲刺激至+60V，引出钠通讲电流(图2A)。以测试电压为横轴，测试电压所对应的尺度化电流值为纵轴，画造给药前后电流的稳态激活直线，钠电流的稳态激活直线用Bltzann圆程拟开得出海马神经元钠通讲给药前后的半激活电压值(1/2)：I/Iax=1/1+exp(V-V1/2)/k。(暗示测试电压所对应的钠电流峰值，1/2暗示50最年夜激活时所对应的测试电压,k为直线的正率)。成果表黑0.1%的复圆两

10、细灵多糖隐着改动了海马神经元稳态激活直线图2a，使半激活电压由给药前的(29.984.30)V去极化偏偏移至(15.852.9)VP0.05,n=16。将膜电位钳造正在90V，采纳单脉冲刺激要收没有俗观观察钠通讲的稳态得活状况，即先赐与10V步幅递删、30s步宽、90V-20V的前提刺激电压，每前提刺激后松跟一30s步宽、20V的测试电压刺激(图2b)。以测试电压所激活的尺度化钠电流峰值I/Iax对前提刺激电压做图画造稳态得活直线，也用Bltzann圆程拟开得出海马神经元钠通讲给药前后的半得活电压值(1/2)：I/Iax=1/1+exp(V-V1/2)/k。(暗示测试电压所对应的钠电流峰值，1

11、/2暗示50最年夜激活时所对应的测试电压,k为直线的正率)。成果创造，0.1%的复圆两细灵多糖给药前后海马神经元稳态得活直线出有隐着改动(55.420.75)Vvs(53.520.88)V,P0.05,n=6)图2b。将膜电位钳造正在90V，采纳单脉冲刺激要收没有俗观观察钠通讲得活后的光复状况，即正在每前提刺激电压后皆施减一测试电压刺激，前提刺激电压战测试电压的宽度均为30s，两次刺激的时隔隔尽从2s开端，以2s等好递删至36s，前提刺激电压战测试电压均为20VFig2。以测试电压所激活的尺度化钠电流峰值I/Iax对时隔隔尽t做图画造得活后的光复直线，并用单指数函数拟开直线，得出钠通讲给药前后

12、得活后光复的工夫常数：I(t)/Iax=A0+A1et。t为前提刺激电压战测试电压之间的时隔隔尽，I(t)暗示测试电压所对应的钠电流峰值，为得活后光复的工夫常数。成果创造，0.1%的复圆两细灵多糖给药前后海马神经元稳态复活直线出有隐着改动(图2)，给药前半复活工夫常数为(6.210.27)s，给药后为(7.380.42)sP0.05,n=6。3会商海马构造是哺乳植物进修记忆构成的闭键脑区，也是缺血缺氧易益天区，海马构造的损害会惹起进修战记忆成果受益7，8。如古觉得细胞内钙离子浓度的删减是慢性脑缺血缺氧惹起海马细胞死亡的慌张去由原果9，因为细胞量内a2+浓度的删下,可继收线粒体内钙储蓄积累，继而

13、可呈现线粒体膜通透性删减，年夜量氧自正在基收死并释放，末极线粒体破坏致细胞能量供给窒碍，惹起细胞死亡10。招致缺血缺氧时神经细胞内钙浓度删减的去由原果许多，而其中神经细胞膜电压依好性钠通讲介导的钠内流减强与细胞内钙超载闭连尤其细细，钠内流减强惹起细胞内钠离子浓度降低，细胞膜及线粒体膜上Na+/a2+交流响应减强，招致细胞量中游离a2+的删减4。正因为神经细胞膜上电压门控性钠通讲正在缺血缺氧时细胞内钙超载收死中的慌张职位，年夜量的研讨事情也试图去证明钠通讲窒碍药正在脑缺血缺氧历程中的神经庇护做用。真践上多种药物也恰是经由过程窒碍神经细胞膜上电压门控性钠通讲而阐扬缺血缺氧历程中的脑庇护做用的510

14、。所以阻断+通讲是近年抗脑缺血缺氧毁伤药物研收中的一个研讨热点。黄细战枸杞为家传珍贵益智中药。古世药理教尝试也证明黑黄细11、枸杞12具有优良的抗衰老、改革聪明病症的做用。黄细、枸杞的益智做用与其正在缺血缺氧历程中的脑庇护做用有闭13，14，其中黄细多糖战枸杞多糖是它们抗缺血缺氧毁伤的慌张活性部位2，3。复圆两细灵为等量黄细、枸杞配伍提与而成，比去的研讨报导指出复圆两细灵对体内中缺血缺氧毁伤模型中的神经细胞均有隐着的庇护与改革做用，那年夜要是复圆两细灵改革进修记忆的慌张去由原果1。但是复圆两细灵正在脑缺血缺氧历程中的神经庇护做用尚缺少份子程度的公仄表黑，造约了该药的临床利用。考虑到正在复圆两细

15、灵的多种组分中，黄细多糖战枸杞多糖是其抗缺血缺氧脑毁伤的慌张活性部位，本研讨利用古世膜片钳尝试妙技，正在慢性疏集的小鼠海马细胞膜上没有俗观观察了复圆两细灵多糖对电压门控性钠通讲的影响。成果创造复圆两细灵多糖可隐着抑造慢性疏集的海马神经元电压门控性钠通讲电流锋值，使钠通讲半激活电压背去极化标的目的偏偏移。根据本尝试研讨成果连开其他的研讨报导，本课题组觉得复圆两细灵改革慢性脑缺血缺氧而至记忆窒碍的机理之一为其多糖组分抑造海马细胞电压门控性钠通讲，有用造止了海马细胞内钙储蓄积累，正在必然程度上削强了海马细胞内钙超载而至海马细胞毁伤。因为本研讨所利用的药品为复圆两细灵的多糖组分，其对海马细胞电压门控性

16、钠通讲的抑造做用是多种果素派相助用的成果借是某单一果素的效应另有待进一步的研讨。参考文献：1黄敬耀，周瑾，魏海，等.复圆两细灵抗老年性聪明的药理尝试研讨J.江西医教院教报，2001，41(2)：5356.2黄芳，陈桃林，受义文.黄细多糖对老龄年夜鼠记忆获得战记忆再现的影响J.利用与状况死物教报，1999，5(1):3939.3钱彦丛，宇文萍.枸杞子的化教果素及药理研讨新盼视J.中医药教报，20004：3335.4artinezS,StriggF,ShrderUH,etal.Na+anda2+hestasispathays,elldeathandprtetinafterxygen-gluse-d

17、eprivatininrgantypihippapalslieulturesJ.Neursiene2022,1284：729740.5HeittKE,StysPK,LesiukHJ.Theuse-dependentsdiuhannelblkerexiletineisneurprtetiveagainstglbalisheiinjuryJ.BrainRes2001，8982：281287.6SangN,engZ.BlkadebyagnesiufsdiuurrentsinautelyislatedhippapalA1neurnsfrat.JBrainRes2002，9522：218221.7Ike

18、daT,ishiaK,AN,etal.binatintreatentfnenatalratsithhypxia-isheiaandendtxinindueslng-lastingeryandlearningipairentthatisassiatedithextendederebraldaageJ.AJbstetGynel2022，1916：21322141.8NEighGN,GlasperER,KflerJ,etal.ardiaarrestithardipulnaryresusitatinreduesdendritispinedensityinA1pyraidalellsandseletivelyaltersaquisitinfspatialeryJ.EurJNeursi2022，207：18651872.9NakauraT,inaisaaH,KatayaaY,et,a