单克隆抗体的制备ebiocore

1、单克隆抗体制备第1页目 录 单克隆抗体介绍 单克隆抗体制备第2页单克隆抗体介绍单抗定义：由一个B细胞克隆或其杂交瘤或经过分子生物学伎俩克隆构建单个抗体基因转染细胞系产生只能识别一个表位高度均质性抗体。单抗制备关键点：制备出一个能够稳定无限遗传能分泌抗体B细胞。所以，需处理两个基本问题：一个能分泌抗体B细胞 免疫动物; 能够稳定遗传 B细胞与瘤细胞融合筛选11第3页Niels K. JerneGeorges J.F. KhlerCsar Milstein第4页B淋巴细胞杂交瘤技术基本原理B细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞第5页流程第6页抗原制备免疫动物骨髓瘤细胞及喂养细胞制备细胞融合 杂交瘤细胞选择培养

2、 杂交瘤细胞筛选及克隆化单克隆抗体大规模制备及纯化单克隆抗体判定 单克隆抗体制备主要步骤第7页一、抗 原 1、分子足够大；2、外源性强；3、结构尽可能复杂；4、可降解性好 一个良好抗原必须详细条件： 1、纯化天然蛋白质；2、纯化重组蛋白；3、人工合成多肽；4、小分子物质；5、组织、全细胞或细胞组分抗原惯用制备方法：第8页 B淋巴细胞在目标抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特异性抗体B淋巴细胞，有利于细胞融合形成份泌特异性抗体杂交瘤细胞。依据抗体亲和力成熟机制，经过屡次免疫使B细胞分泌高亲和力抗体，由此形成杂交瘤往往可分泌高亲和力抗体，有更高应用价值。 二、免疫动物 免疫目：第9页 采取与骨髓瘤供

3、体同一品系动物 免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远则产生杂交瘤越不稳定，取得杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。 动物选择： 动物反抗原刺激易产生免疫应答反应 制备单抗使用主流动物：小鼠（最惯用BALB/c）第10页 免疫方案确实定：在设计免疫程序时，应考虑到抗原性质和纯度、抗原量、免疫路径、免疫次数与间隔时间、佐剂应用及动物对该抗原应答能力等。没有一个免疫程序能适合用于各种抗原。第11页 脾（spleen）抗原脾（spleen）1.制备良好抗原2.选择适当免疫动物3.确立适宜免疫方案第12页 所选骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞动物 品系相同三、骨髓瘤细胞及喂养细胞制备骨

4、髓瘤细胞系选择关键点：选择DNA合成主要路径缺点型骨髓瘤细胞（HGPRT-或TK-）第13页喂养细胞作用： 小鼠腹腔巨噬细胞小鼠脾细胞、胸腺细胞、放射线照射成纤维细胞系 喂养细胞（feeder cell）： 增加细胞密度，满足新生杂交瘤细胞对 细胞密度要求 吞噬去除死亡细胞 分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞生长喂养细胞种类和制备方法：第14页四、细胞融合PEG脾细胞准备骨髓瘤细胞准备细胞融合骨髓瘤细胞与脾细胞按一定百分比混合1: 10或1: 5，加入促融剂PEG第15页 在聚乙二醇作用下B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞3种杂交细胞：B-B融合细胞、杂交瘤细胞 瘤-瘤融合细胞未融合

5、细胞：单个B细胞、单个骨髓瘤细胞第16页HAT选择性培养原理： 细胞DNA生物合成有主要路径和赔偿路径。当有氨基碟呤存在时，能够阻断DNA合成主要路径，需经过赔偿路径合成DNA，这时就需要次黄嘌呤利用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）合成DNA，或胸腺嘧啶核苷利用胸腺嘧啶核苷激酶（TK）合成DNA。第17页第18页 融合后34天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮克隆。 融合后第79天取培养上清，检测特异性抗体。细胞生长情况第19页六、杂交瘤细胞筛选及克隆化 在HAT培养基中生长杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体细胞，所以，必须进行筛选和克隆化。 克隆化即把培养孔中细胞从单个

6、细胞进行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌抗体到达均一性。有限稀释法、半固体培养、显微操作法、荧光激活细胞分离法第20页mm1144332242444233324444422244333333333有限稀释法确保能分离出单个细胞重新形成克隆。第21页七、单克隆抗体大规模制备 动物体内诱生法 取Balb/c小鼠, 首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。 12周后, 腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体第22页约12周, 可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可取得大量单克隆抗体。 第23页 将杂交瘤细胞置于培养瓶（或灌）中进行培养。在培养过程中，杂交

7、瘤细胞产生并分泌单克隆抗体。搜集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可取得所需要单克隆抗体，不含无关Ig，但成本髙。体外培养法 第24页盐析沉淀凝胶过滤亲和层析离子交换层析八、单克隆抗体纯化第25页盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出过程。亲水胶体在水中稳定原因有两个：即电荷和水膜。因为中性盐亲水性大于蛋白质和酶分子亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。中性盐选择:(NH4)2SO4 溶解度大; 分离效果好; 不易引发变性，有稳定酶与 蛋白质结构作用; 价格廉价，废液不污染环境。第26页IgM第27页离子交换法原理: 是抗体本身带有电荷，当其经过适当离子交换柱填料时，能够交换下填料上原有相同电荷离子，从而与腹水中其它带不一样电荷杂质分离开来，最终再用离子强度高缓冲液洗脱。第28页亲和层析：将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化抗体（或抗原）。第29页 单抗理化特征判定 九、