小鼠脚趾DNA提取以及基因型鉴定

1、骨代谢研究室标准操作规程小鼠脚趾 DNA提取以及 Macf1fl/flC57BL/6-Prrx1-Cre 小鼠基因型鉴定张茹2016年3月15日一 .小鼠脚趾DNA提取【原理】.提取过程真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备 DNA的 原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持 DNA分子的完整。 提取DNA的过程是将动物组织在含SDS （十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的消化 液中消化分解蛋白质，再用酚抽提分离蛋白质，得到的 DNA溶液经乙醇沉淀使 DNA析出来。.裂解液各成分作用在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂 质，从而使细胞裂

2、解，并使组织蛋白与 DNA分离。EDTA可以整合镁离子，这 样将会抑制细胞中Dnase的活性；因为该酶必须在有镁离子存在下才会起作用。 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA （乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很 高的活性。并且可将蛋白质降解成小肽或氨基酸， 使DNA分子完整地分离出来。.Tris苯酚作用酚是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚混合时，蛋白质分子之 间的水分子就被酚挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心， 变性蛋白质的 密度比水的密度为大，因而与水相分离， 沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中 的DNA分开。而酚作为有机溶剂比重更大，保留在最下层。【实验材料】.耗材1.5m

3、l离心管，水浴锅，高速冷冻离心机，1ml移液枪，200ul移液枪，通风 橱，1ml移液枪枪头，200ul移液枪枪头。.试剂Tris-HCl , EDTA, NaCl, SDS,灭菌水，Tris苯酚，无水乙醇，75%乙醇，1倍骨代谢研究室标准操作规程TE缓冲液【实验步骤】1.SNET 裂解750 ( 50ml) : 100mM Tris-HCl (10ml, PH8.0), 200mM EDTA (1.25mlPH8.0),1M NaCl (20ml), 10% SDS (5ml), 水(13.75ml)。(裂解液在常温下结晶，使用之前在55c水浴锅中预热)蛋白酶K (PK):储存浓度：10mg

4、/ml;终浓度：100ug/ml2、操作步骤:1）小鼠标记编号，并收集小鼠脚趾样品于1.5mlEP管中（提前高压灭菌）2）提前准备55c水浴锅，并把4c离心机打开（300rmp离心降温至4C）。3）往装有小鼠脚趾组织的EP管里加入400ul Snet裂解液，4ul蛋白酶K （实验 经验，充分消化可加6-7ul）,其浓度是10mg/ml,即终浓度为100ug/ml;4）置于55c水浴锅中裂解1h （实验经验，充分裂解需 2.5-3.5h）;5）待组织裂解完后，在通风厨中加入 400ul Tris饱和酚（除去蛋白质杂质），剧 烈震荡20s （实验经验，剧烈震荡100多次），至呈乳浊液；6） 12,

5、000g, 4C,离心10min （所有管子方向一致）；7）吸取上清330-390ul于新的EP管中（缓慢吸取，勿吸到蛋白层），加二倍体 积的无水乙醇（即660-780ul）,轻摇出现白色絮状沉淀（轻摇100多次，充 分混匀）；8）同第五步离心后，用1ml枪头一次吸取上清，留剩余刚好淹没沉淀；9）加 1ml 75%乙醇,12,000g , 4c离心 5min；10）用1ml枪头一次吸取上清，留剩余刚好淹没沉淀；11）12,000g , 4 c 离心 3min；12）用200ul枪吸干上清（在沉淀对面吸取），通风橱中晾干；13）根据沉淀量多少加2050ul无菌水溶解DNA沉淀，吸吹1015次，混

6、匀。骨代谢研究室标准操作规程Macflfl/flC57BL/6-Prrx1-Cre 小鼠的基因型鉴定.鉴定原理鉴定Macf1fl/flC57BL/6-Prrx1-Cre 小鼠的基因型，要基于本小鼠构建的原理。本小鼠模型构建基于 Cre/LoxP系统的条件性基因敲除技术，即在组织或细胞特异 性Cre重组酶转基因小鼠的作用下，实现在特定细胞及特定发育阶段敲除目的基因研究其 功能。本研究在骨髓间充质干细胞的标记分子Prrxl基因中插入 Cre基因，即构建为Prrx1-Cre小鼠，特异性的表达 Cre酶。LoxP位点标记 MACF1基因片段，即构建为 MACF1-Flox小鼠。这两种小鼠交配，使得Cr

7、e基因被可诱导的 Prrx1启动子控制，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的MACF1基因切除，从而繁殖得到骨髓间充质 干细胞中特异性敲除 MACF1基因的小鼠。通过设计引物，pcr扩增片段长度，判断子代小鼠是否插入LoxP位点，以及是否插入Cre位点，从而鉴定子代小鼠基因型。Cre重组酶敲除LoxP修饰位点的过程.鉴定方案及鉴定图Macf1打靶的基因型鉴定引物设计位点引物设计在 LoxP插入的基因片段上，LoxP位点长34bp,野生型片段片段长700bp,含LoxP位点的片段长 750bp。Wildtype allelefWT)WT-F WT -ftE1厂一| E2 E3 E4Ta

8、rgeted allele(ff-heo)骨代谢研究室标准操作规程PCR引物序列信息PrimerSequenceProduct sizeMACF1#P179AAAGAAACGGAAATACTGGCCTOObp55MACF1P180GCAGCHAATTCTGC CAAATTC54PCR反应程序951c5min95t30sec35 cycle62t30sec72YJ36sec721ClOmin4C10rrin鼠尾DNA的基因型鉴定结果若只能扩增得到700bp条带，说明小鼠是野生型；若只能得到750bp条带，说明是 纯合子小鼠；若能得到700bp和750bp两个条带，说明是杂合子小鼠。Prrx1-i

9、Cre的基因型鉴定：引物设计位点鉴定是否含Cre基因。需要两种引物，一种用来扩增野生型的短片段， 一种用来扩 增突变型的长片段。 WT-F/R设计在基因组上，用于扩增野生型产物 （267bp）; Mut-R引 物设计在Cre上，WT-F/Mut-R引物用来扩增突变型产物 （322bp）。骨代谢研究室标准操作规程Wildtype alleleTargete(iafieleCre基因的鉴定PCR引物信息PrimerPmcl-iCre-WT-FPrrxl-iCre-WT-RPrrxl-iCre-WT-FiCre-Mut-R2sequenceAGCGTTTGGTGTTGATTCGAGCAGTCCCGGTGACTCCAGCAGAGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC606262GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG 60ProductsizeWT267bpMut:322bpPCR反应程序95七5min95 c5min95已30sec35 cycle95Y?30sec35 cycle62七30sec621;30sec72T?20sec72X?25sec72T?10min72t10min10min10min鼠尾DNA的基因型鉴定结果Prrxl-iCre -WT-F/iCre-Mut-R21SZC 2SZC1d2 2-29 1-5 1-21 1-23 1-1