海洋保健食品 第七章海洋保健食品的功能评价

1、 海 洋 保 健 食 品第七章 海洋保健食品的功能评价：动物实验是指声称具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品，即适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或者慢性危害的食品。保健食品：学 习 要 求掌握保健食品毒理学评价和功能评价的要求掌握实验动物的概念及分类熟悉保健食品评价的法规与标准熟悉保健食品功能评价的实验项目了解保健食品注册相关程序及要求一、概述二、保健食品毒理学评价三、保健食品功能学评价：动物实验内 容 提 纲6客户提出检验要求提供相关材料出具受理通知书卫生学、稳定性试验毒理学检验功能学检验特定功效成分感官指标理化指标微

2、生物指标急性毒性、遗传毒性亚慢性、慢性毒性动物实验人体试验检验报告客户接受报告保健食品注册检验受理程序1、评价程序和检验方法依据国务院: 中华人民共和国食品卫生法 (2015)卫生部：保健食品管理办法（2013）卫生部：新食品原料申报与受理规定和新食品原料安全性审查规程(2013）卫生部：食品安全性毒理学评价程序和方法 (GB15193.1-2014） 保健食品功能学评价程序与检验方法规范（2003） SFDA： 保健食品注册与备案管理办法（2016） 国家安全风险评估中心等单位保健食品注册检验机构及检验项目 检验机构名称注册检验项目范围 国家食品安全风险评估中心 安全性毒理学试验、功能学动物

3、试验（1、增强免疫力功能 2、辅助降血脂功能3、辅助降血糖功能4、抗氧化功能5、辅助改善记忆功能6、促进排铅功能7、清咽功能8、辅助降血压功能9、改善睡眠功能10、促进泌乳功能11、缓解体力疲劳功能12、提高缺氧耐受力功能13、对辐射危害有辅助保护功能14、减肥功能15、改善生长发育功能16、增加骨密度功能17、改善营养性贫血功能18、对化学性肝损伤有辅助保护功能19、调节肠道菌群功能20、促进消化功能21、通便功能22、对胃粘膜损伤有辅助保护功能）、功效成分或标志性成分检测、卫生学试验、稳定性试验、复核检验中国检验检疫科学研究院综合检测中心 安全性毒理学试验、功能学动物试验（1、增强免疫力功

4、能 2、辅助降血脂功能3、缓解体力疲劳功能4、调节肠道菌群功能能5、通便功能）、功效成分或标志性成分检测、卫生学试验、稳定性试验82、实验动物实验动物（laboratory animals, LA）是指人工培育，来源清楚，遗传背景明确，对其携带的微生物和寄生虫实行监控，用于生命科学研究、药品与生物制品生产和检定以及其他学科研究的动物。 遗传学要求微生物和寄生虫监控要求应用要求三大特点实验用动物实验用动物实际上是指一切可以用于实验的动物，包括：实验动物，野生动物，经济动物、观赏动物。常用实验动物小鼠，大鼠，豚鼠，地鼠，家兔，猫，犬，鸡，小型猪，猕猴等 。3、实验动物品系分类一般按遗传背景分类：

5、分为四类：近交系； 突变系； 封闭群； 系统杂交动物1）近交系（Inbred Strain）概念：同胞兄妹交配（繁殖）20代以上，近交系数达98.6%以上，群体基因达到高度纯合和稳定的动物群，称之为近交系。 近交系数：群体中两个等位基因源于同祖先的同一基因的概率。一般近交812代的近交群没有实用价值，只有连续20代以后，群体基因才能达到纯合和基本稳定。 近交系动物的特点：a基因位的纯合性：纯合率达98.6%，因而能繁殖出完全一致的纯合子后代，品系内个体繁殖的后代不会出现性状分离。 使用近交系动物实验时，不会因为隐性基因暴露而影响试验结果。b.遗传的同源性c.遗传的长期稳定性d.均一性e.遗传组

6、成的独特性f.国际分布性 目前常用的近交系实验动物： 目前有：250个小鼠品系，111个大鼠品系， 20个家兔，14个豚鼠品系。 常用的小鼠、大鼠近交系： 小鼠：C57BL，C3H，BALB/C，DBA/2等。 大鼠：F344，LEW，BN，SHR，DA等。C57BLBALB/C2）封闭群（Closed Colony）概念：又称远交原种，或非近交系。把5年以上不从外引种，只在群内随机配对繁殖，而生产的动物，群内有效大小应保持在50只以上。特点：a. 杂合性，避免了近交衰退现象，生命力较强，易于生产，成本低。多用于预试验，教学及一般实验中。b. 具有异质遗传，常用于人类遗传学研究，药物筛选，毒性

7、试验等方面。c. 遗传特性相对稳定，但试验结果的重复性，一致性低于近交系、系统杂交动物。 常用的封闭群动物：小鼠：KM，NIH，ICR，LACA，大鼠：Wistar，SD，兔：青紫兰兔，新西兰兔。KMWistarSD新西兰兔3）突变系（Mutant Strain）概念：正常染色体基因发生突变，具有了各种遗传缺陷，将需要的某种遗传缺陷动物，再进行定向培育成具有突变基因的近交系，称为突变系。或利用遗传工程方法将突变基因导入已育成的近交系，这种具有突变基因的近交系也称突变系。突变系动物的特点和应用突变系动物可以作为人类疾病的动物模型。常用突变系动物：小鼠：100多种。如，肥胖症小鼠（od），糖尿病小

8、鼠（db）,裸鼠（nu）等。大鼠，20多种。如，新西兰高血压大鼠（GHR），米兰高血压（MHS），粮尿病大鼠（di），肥胖症大鼠（fa），白内障大鼠（rc）等。4）系统杂交动物（Hybrid Animal）概念：两个不同的近交系杂交所产生的F1代动物。F1动物具有杂交优势，生命力较强。特点及应用系统杂交动物有许多优点，在某些方面比近交系更适用于实验研究。a.杂交优势：抗病力、适应力强，对实验处理耐受性强，适合于长期慢性实验。b.遗传和表型上的一致性：F1有与近交系相似的个体均质性。加上上述优点，广泛适用于营养，药物，病原体和激素的生物评估。c.具有杂合的遗传组成：可同时接受两个亲本品系的细胞、

9、组织，器官和肿瘤移植。4实验动物的级别分类级别分类，一般是按实验动物的微生物背景划分的，这是实验动物质量控制的一个重要方面。国际上一般分为四级：无菌动物（germfree animal, GF）悉生动物（gnotobiotic animal, GN）无特定病原体动物（specific pathogen free animal ,SPF）普通动物（conventional animal, CV）对微生物的控制要求GF：以无菌技术获得，不带任何微生物和寄生虫，在隔离系统饲养。GN：带有明确的微生物丛，无菌条件饲育，在隔离系统饲养。SPF：不带指定的病原微生物和寄生虫，在屏障系统饲养。CV：微生物、

10、寄生虫携带性情况不明，但不能带有人畜共患和烈性传染病原体，在开放系统饲养。实验动物标准化生产条件、动物质量和动物实验条件的标准化。动物实验条件实验动物生产条件相匹配影响因素遗传微生物/寄生虫环境营养一、概述二、保健食品毒理学评价三、保健食品功能学评价：动物实验内 容 提 纲保健食品评价食品毒理学评价食品功能学评价食品卫生学、稳定性评价动物实验251、食品毒理学评价常用实验动物常用的实验动物1. 大鼠（Rattus norvegcus ）(常用，重要)哺乳纲啮齿目鼠科。食性广泛，寿命-3年，性成熟期2-3月，孕期30天，一年产仔4-7胎，哺乳期30天。饲养；安静、通风、18-25、湿度30-50

11、%。长方铁丝笼、5只、雌雄分养。饲养方法上午喂一次，30-35g。清洁水。262.小鼠（Mas musculus ）(常用)哺乳纲啮齿目鼠科，寿命2年，性成熟期雌：35-55天，雄：45-60天，孕期20-25天，一年产仔4-9胎，哺乳期30天。饲养: 安静、通风、光线较暗、18-25、湿度50-60%。长方铁皮鼠盒、10只、雌雄分养。生长速度快、耗粮少、易捉。饲养方法：上午喂一次，30-35g。清洁水 。272、保健食品的毒理学评价原理与方法 对保健食品的毒理学评价是确保人群食用安全的前提。严格按照卫生部食品安全性毒理学评价程序和方法 GB15193进行，主要评价食品生产、加工、保藏、运输和

12、销售过程中使用的化学和生物物质以及上述过程中产生的和污染的有害物质、食物新资源及其成分和新资源食品。对于功能食品及功效成分必须进行食品安全性毒理学评价程序和方法中规定的第一、二阶段的毒理学试验，依据评判结果决定是否进行三、四阶段的毒理学试验。若功能食品的原料选自普通食品原料或已批准的药食两用原料则不再进行试验。283、毒理学评价试验的四个阶段与试验原则（1）试验的四个阶段第一阶段：急性毒性试验，包括经口急性毒性（LD50）和联合急性毒性。第二阶段：遗传毒性试验、传统致畸试验、短期喂养试验。第三阶段：亚慢性毒性试验（90天喂养试验）、繁殖试验和代谢试验。 亚慢性毒性：材料或其浸提液每天一次或多次

13、给予后，在寿命期的一段时间内(不超过动物寿命期的10%，如大鼠一般不超过90天)引起的不良反应。 第四阶段：慢性毒性实验（包括致癌试验）29（2）功能食品特别是功效成分的毒理学评价原则： 凡属我国创新的物质：四个阶段的试验。 凡属与已知物质（指经过安全性评价并允许使用者）的化学结构基本相同的衍生物或类似物：根据第一、二、三阶段毒性试验结果判断是否需进行第四阶段的毒性试验。 凡属已知的化学物质，世界卫生组织已公布每人每日容许摄入量（ADI），同时又有资料证明我国产品的质量规格与国外产品一致：可先进行第一、二阶段毒性试验，若试验结果与国外产品的结果一致，一般不要求进行进一步的毒性试验，否则应进行第

14、三阶段毒性试验。30 食品新资源及其食品：应进行第一、二、三个阶段毒性试验，以及必要的人群流行病学调查。必要时应进行第四阶段试验。若根据有关文献资料及成分分析，未发现有或虽有但量甚少，不至构成对健康有害的物质，以及较大数量人群有长期食用历史而未发现有害作用的天然动植物（包括作为调料的天然动植物的粗提制品）可以先进行第一、二阶段毒性试验，经初步评价后，决定是否需要进行进一步的毒性试验。 凡属毒理学资料比较完整，世界卫生组织已公布日允许量或不需规定日允许量者，要求进行急性毒性试验和一项致突变试验，首选Ames试验或小鼠骨髓微核试验。31 凡属有一个国际组织或国家批准使用，但世界卫生组织未公布日许量

15、，或资料不完整者，在进行第一、二阶段毒性试验后作初步评价，以决定是否需进行进一步的毒性试验。 天然植物提取的单一组分，高纯度的添加剂，凡属新产品需先进行第一、二、三阶段毒性试验，凡属国外已批准使用的，则进行第一、二阶段毒性试验。 凡属尚无资料可查、国际组织未允许使用的，先进行第一、二阶段毒性试验，经初步评价后，决定是否需进行进一步试验。32复习思考题：（1）保健食品评价为什么要进行毒理学评价？评价项目包括哪些？（2）实验动物的概念、级别及分类有哪些？ （3）近交系、突变系、封闭群、系统杂交动物的特点及各自的主要品系？ 一、概述二、保健食品毒理学评价三、保健食品功能学评价：动物实验内 容 提 纲

16、海洋保健食品的功能评价动物实验人体试食实验细胞水平功能检验应用于保健食品审评的保健食品功能学共有27个项目。其中需要做人体试食试验的项目有20个；有7个项目不需做人体试食试验；有15个项目既要做动物实验，又要做人体试食试验；有5个项目只需做人体试食试验，而不需做动物实验（详见下表）。保健食品功能一览表序号项目需动物实验需人体试食试验1辅助降血脂功能2辅助降血糖功能3抗氧化功能4辅助改善记忆功能5促进排铅功能6清咽功能7辅助降血压功能8促进泌乳功能9减肥功能10改善生长发育功能11改善营养性贫血功能12调节肠道菌群功能13促进消化功能14通便功能15对胃粘膜损伤有辅助保护功能保健食品功能一览表序

17、号项目需动物实验需人体试食试验16缓解视疲劳功能17祛痤疮功能18祛黄褐斑功能19改善皮肤水份功能20改善皮肤油份功能21增强免疫力功能22改善睡眠功能23缓解体力疲劳功能24提高缺氧耐受力功能25对辐射危害有辅助保护功能26对化学性肝损伤有辅助保护功能27增加骨密度功能：“”表示需要；“”表示不需要。（一）检验时限39此七种功能只需进行动物试验，不需要进行人体试验增强免疫力改善睡眠对化学性肝损伤有辅助保护对辐射危害有辅助保护功能缓解体力疲劳提高缺氧耐受力增加骨密度1、增强免疫力功能检验细胞免疫功能的检测体液免疫功能的检测单核巨噬细胞功能的检测NK细胞功能的检测 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转

18、化试验 小鼠迟发型变态反应抗体生成细胞检测血清溶血素的测定小鼠碳廓清实验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验乳酸脱氢酶（LDH）测定法1、增强免疫力功能检验实验动物 推荐用近交系小鼠，18-22g，单一性别，每组10-15只 剂量分组 至少设置三个剂量组和一个阴性对照组，必要时设置阳性对照组或空白对照组。剂量选择应合理，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，尽可能找出最低有效剂量。受试样品给予时间 30天，必要时可延长至45天增强免疫力功能的结果判定 增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品增强免

19、疫力。NK细胞活性结果判定：测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。测定实验的两个剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。细胞免疫功能结果判定：体液免疫功能结果判定：单核巨噬细胞功能结果判定：1）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应（MTT法）ConA：刀豆蛋白A； MTT：四甲基偶氮唑盐原理：当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞增殖反应，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT分解为蓝紫色结晶显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。脾细胞悬液配置无菌条件下取小鼠脾脏，置于盛有适量无菌PBS液的平皿中；切碎小鼠脾脏，纱网过滤

20、，制成单细胞悬液；PBS液洗2次，每次1000rpm/min，离心5min；细胞悬浮于1ml完全培养基中；台盼兰染色，计数活细胞数（应在95%以上）；调整细胞浓度为3x106个/ml。淋巴细胞增殖反应脾细胞悬液加入96孔培养板中，100 l/孔；实验组加最适剂量的ConA液，5%CO2，37 培养箱培养68h；细胞饥饿培养24h，加入CCK8液，继续培养4h ；酶标仪检测450nm 处光密度值。结果判定淋巴细胞的增殖能力=加ConA孔的光密度值 - 不加ConA孔的光密度值方差分析，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法统计，若P 0.05，各组均数间显著性差异，若P 0.05，组均数间

21、无显著性差异。受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该实验结果阳性2）小鼠迟发型变态反应实验（耳肿胀法）原理： 二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将其稀释液涂抹小鼠腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖程致敏淋巴细胞。4-7d后将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部产生迟发型变态反应（肿胀）。一般在抗原攻击后24-48h达高峰，故于此时测定其肿胀程度。肿胀程度反应迟发型变态反应程度。DNFB溶液配制：新鲜配制，称取DNFB50mg，置于清洁干燥小瓶中，将预先配制好的5ml 丙酮麻油溶液（V/V=1:1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封，混匀后，用注射器通过

22、瓶盖取用。致敏激发小鼠腹部皮肤脱毛，范围约3cm*3cm，DNFB溶液50l均匀涂抹致敏。5天后，用DNFB溶液10l均匀涂抹于小鼠左耳（两面）进行激发；触发24h后，游标卡尺测量左右耳廓厚度；处死小鼠，剪下左右耳；打孔器取下直径8mm的耳片，称重。各组小鼠在致敏激发后均出现不同程度的耳廓红肿、渗出，第3次激发后各组小鼠皮损处出现轻微结痂。模型组左耳相比右耳明显变厚，且血管清晰可见。结果判定 用左右耳重量之差表示迟发型变态反应的程度，受试样品组的重量差值显著高于对照组的重量差值（ P 0.05 ），可判定该项实验结果阳性。注意事项 操作时避免DNFB与皮肤接触。3）抗体生成细胞检测（Jerne

23、改良玻片法）制备SRBC原理：用绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数可反映抗体分泌细胞数。SRBC与脾细胞共孵育免疫动物制备脾细胞悬液制备补体补体参与形成溶血空斑制备SRBC免疫动物制备脾细胞悬液制备补体玻片小室的制作细胞混合液的配制混合细胞的灌注取洁净（无油）的载玻片，按图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合

24、液。封小室开口37温箱中孵60分钟溶血空斑计数3.玻片小室的制作取洁净（无油）的载玻片，按图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合液。4. 细胞混合液的配制：取小试管一只，将指示细胞悬液与脾细胞悬液，混匀。5. 混合细胞的灌注：于小室开口一端轻轻将细胞混合液注满小室，记录实际注入的细胞悬液微升数（约70 ul）。每个样品注2个小室，取其平均值。6. 用牙签粘取少许凡士林封小室开口。7. 将作好的标本水平置湿盒中，放37温箱

25、中孵60分钟8. 溶血空斑计数：肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查，真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。全脾脏中抗体产生细胞总数可依下述公式计算：结果判定 空斑数/106脾细胞数（或空斑数/全脾细胞数）表示抗体生成细胞 受试样品组的空斑数或空斑数/全脾细胞数显著高于对照组的空斑数（ P 0.05 ），可判定该项实验结果阳性。4.小鼠腹腔鸡红细胞实验（滴片法）原理：巨噬细胞属机体的非特异性免疫细胞，在有异物侵入的时候，血液中释放出巨噬细胞吞噬异物。鸡红细胞相对小鼠是异体抗原性物质，当被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔巨噬细胞聚集并吞噬，这是衡量

26、机体非特异性免疫功能的主要指标。利用巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有黏附的特性，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载玻片上，加入鸡红细胞，孵育一段时间后，冲洗掉未黏附的细胞，固定染色，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。结果判定 用40 显微镜观察每100个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数，计算吞噬率和吞噬指数。 受试样品组的吞噬百分率和吞噬指数与对照组相比，差异均有显著性，方可判定该项结果阳性。小鼠腹腔中的巨噬细胞腹水中的巨噬细胞此七种功能只需进行动物试验，不需要进行人体试验增强免疫力改善睡眠对化学性肝损伤有辅助保护对辐射危害有辅助保护功能缓解体力疲劳提高缺氧耐受力增加骨密度二、改善睡眠功能检验直接睡眠实验 比较对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间的差异，若入睡动物数及睡眠时间增加有显著性，则