蛋白质化学5,6课件

1、蛋白质化学第 四 章1复 习蛋白质的结构层次：基本结构：一级结构高级结构（空间结构）：二级结构三级结构四级结构维持蛋白质天然构象的化学键2三、蛋白质和多肽合成的基本原理（一）化学合成法的基本原理在蛋白质和多肽一级结构阐明以后，如何用化学方法来合成具有生物活性的多肽和蛋白质成为一项非常重要的研究方向。1958-1965 中国人工合成牛胰岛素，成为第一个合成蛋白质的国家虽错失了诺贝尔奖但意义重大3（一）化学合成法的基本原理1.氨基酸的基团保护封闭保护基团，避免在接肽缩合反应中不该参与反应的基团发生反应，如-SH，-OH，-NH2和-COOH。保护基的条件：在接肽缩合时起保护作用，接肽后易除去而不引

2、起肽键的断裂。氨基保护：卞氧羰酰氯（Cbz-Cl）与氨基反应后，用H2/Pd或钠-液氨法除去羧基保护：无水乙醇酯化，碱水解除去4（一）化学合成法的基本原理2.氨基酸的液相合成三步法5（一）化学合成法的基本原理3.多肽的固相合成Merrifield（1963）首创，用取代的树脂作固相载体合成多肽。基本原理是将合成的肽链羧基借酯键与载体相连，除去氨基保护基，用接肽缩合剂，将一个新的氨基酸羧基连接上，重复。DNA 固相合成法的基本原理：与多肽固相合成法相似。先将目标 DNA 链 3-端核苷上的 3-OH 与树脂(固相)共价相连，然后将经过活化的单体核苷酸(不参加反应基团必须保护), 按设计的顺序依次

3、加上去。6固相合成71.一级结构不同生物学功能各异一、蛋白质一级结构与功能的关系 102.一级结构“关键”部分相同，功能相同促肾上腺皮质激素（ACTH）的活性必需来自于1-24肽段。113.“关键”部分变化，活性也随之改变4.一级结构的变化与疾病的关系镰刀状红细胞贫血122.蛋白质的变构现象凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质（配体，ligand）相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生（如疯牛病）。16蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互

4、聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨丁顿舞蹈病、疯牛病等。17疯牛病：是一种侵犯牛中枢神经系统的慢性的致命性疾病，由一种非常规的病毒朊病毒（Prion）引起的一种亚急性海绵状脑病，这类病还包括绵羊的痒病、人的克-雅氏病（Creutzfeldt-Jakob Syndrome , CJD）（又称早老痴呆症）以及最近发现的致死性家庭性失眠症等等。特征：在病牛中出现中枢神经系统出现变化，行为反常，烦躁不安，对声音和触摸，尤其是对头部触摸过分敏感，步态不稳，经常乱踢以至摔倒、抽搐。直至死亡。18疯

5、牛病疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPSc，从而致病。191.分子筛层析法232.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质所带电荷和分子大小的不同，在电场中的电泳速度各异，加入SDS则将其电泳的速度取决于分子量而与电荷无关。24二、蛋白质的变性变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。1.变性的本质252.变性作用的特征 生物活性的丧失 理化性质的改变263.

6、造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 27三、蛋白质的两性电离与等电点蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 28蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦

7、等技术分离蛋白质。29蛋白质 酸性氨基酸数 碱性氨基酸数 pI胃蛋白酶 37 6 1.0胰岛素 4 4 5.35RNA酶 10 18 7.8细胞色素c 12 25 9.810.8 pHpI, 蛋白质带负电, 体内蛋白质的pI大多为5.0左右, 故生理条件下一般以负离子形式存在。30四、蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。 蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜31方法所用物质原理应用盐析中性盐，如(NH4)2SO4破坏水化膜，中和其电荷，且蛋白质不会变性分离提纯蛋白质重金属离子沉淀Hg2+,Pb2+,Cu2+,A

8、g+等pHpI时，中和其负电荷临床上抢救重金属中毒；低温制备未变性蛋白质生物碱试剂及某些酸类沉淀苦味酸,钨酸,鞣酸,三氯醋酸等pHpI时，中和其正电荷除去样品中的杂蛋白有机溶剂沉淀乙醇，甲醇，丙酮等破坏水化膜酒精消毒灭菌；低温分离制备血浆蛋白34六、蛋白质的颜色反应茚三酮反应蛋白质分子内含有游离的氨基，可与水合茚三酮反应呈色。 双缩脲反应双缩脲由两分子尿素脱氨缩合生成，在碱性溶液中与Cu2+作用呈紫红色，称为双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键也能发生此反应，可用来检测蛋白质水解程度。35酚试剂反应酚试剂含有磷钼酸-磷钨酸，与蛋白质的呈色反应比较复杂。在碱性条件下，蛋白质与Cu2+作用生成螯合物。该

9、螯合物在碱性条件下将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，呈深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)。酚试剂反应的灵敏度比双缩脲反应高100倍，常用于蛋白质的定量分析。3637蛋白质分离和纯化The separation and purification of Protein第 六 节38一、蛋白质的提取选择合适的材料（高含量）组织细胞的粉碎根据植物，动物以及不同的材料选择提取：最大限度的提取蛋白质又最小限度的防止污染和其他物质对蛋白质结构的影响39二、蛋白质的分离和纯化1.根据溶解度不同的分离纯化方法 等电点沉淀 盐析沉淀低温有机溶剂沉淀法温度对蛋白质溶解度的影响：0-40 球状蛋白质溶解度增加40-50 不稳定开

10、始变性402.根据分子大小不同的分离纯化方法 透析和超滤41 分子排阻层析（凝胶过滤）利用蛋白质分子量的差异，通过具有分子筛性质的凝胶而分离 大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布在颗粒之间，其流程短，遇到的阻力小，所以在洗脱时向下移动的速度较快，先流出层析柱 。分子筛效应42433.根据电离性质不同的分离纯化方法 电泳法在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳(electrophoresis) 在电场中，推动带电粒子运动的力(F)等于粒子所带净电荷量(Q)与电场强度(E)的乘积，即： FQE44带电粒子（样品）在电场中的泳动速度，首先与其本身所带净电荷的

11、多少、颗粒大小和形状有关 醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维素薄膜为支持物，常作临床血浆蛋白分析；聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，具有电泳和凝胶过滤的特点；SDS：由于SDS带负电，使各种蛋白质- SDS复合物都带上相同密度的负电荷，并大大超过蛋白质分子原有的电荷量；同时不同蛋白质-SDS复合物形状也相似。因此在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，电泳迁移率就取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也就是说取决于蛋白质分子量的大小4546 离子交换层析474.根据配基特异性的分离纯化方法亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 48三、蛋白质的纯

12、度鉴定含量测定和结构分析1.蛋白质纯度的鉴定 层析法电泳法：是否样品呈现单一区带免疫化学法：根据抗原和抗体反应的特异性，可用已知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体492.蛋白质含量的鉴定 克氏定氮法：根据含氮量16%来测定蛋白质的含量福利-酚试剂法：蛋白质和Cu生成复合物，还原磷钼酸-磷钨酸试剂生成蓝色化合物，再用比色法测定双缩脲法紫外分光光度法：芳香族氨基酸在280nm最大吸收峰503.蛋白质结构鉴定技术物理分析化学分析：氨基酸分析及序列分析51* 根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质缀合蛋白质：含非氨基酸成分(脂类，糖等)* 根据蛋白质构象 纤维状蛋白质球状蛋白质 第七节 蛋白质的分类52小结掌握蛋

13、白质的结构和功能的关系。熟悉蛋白质的性质。了解蛋白质分离和纯化的基本原理和常用方法。531.变性蛋白质的特点是 A.粘度下降 B.丧失原有的生物活性 C.颜色反应减弱 D.溶解度增加 E.不易被胃蛋白酶水解 B542.蛋白质变性是由于 A.蛋白质一级结构改变 B.蛋白质空间构象的改变 C.辅基的脱落 D.蛋白质水解 E.以上都不是 B553.可用于蛋白质定量的测定方法有 A.双缩脲法 B.紫外吸收法 C.Folin酚试剂法 D.凯氏定氮法 E.以上都可以 E564.血浆蛋白质的pI大多为pH5-6，它们在血液中的主要存在形式是 A.兼性离子 B.带负电荷 C.带正电荷 D.非极性分子 E.疏水分子B评析：血液中的pH为7.2,大于血浆蛋白质的等电点,因此血浆蛋白质在血液中带负电荷。575.蛋白质溶液的稳定因素是 A.蛋白质溶液的粘度大 B.蛋白质在溶液中有布朗运动 C.蛋白质分子表面带有水化膜和同种电荷 D.蛋白质溶液有分子扩散现象 E.蛋白质分子带有电荷C58选择题 A.碱性氨基酸 B.亚氨基酸 C.芳香族氨基酸 D.含硫氨基酸 E.含羟基氨基酸 1.脯氨酸 2.色氨酸 3.蛋氨酸 4.丝氨酸 5.组氨酸