植酸酶的测定

1、植酸酶活性的测定一、测定原理铜黄法（偏帆酸铉法）原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下，水解底物植酸钠，生成正磷 酸和肌醇衍生物，在酸性环境中,用帆钥酸铉处理生成黄色复合物，在415nm波长下进行比色 分析。二、反应条件的探讨1、反应体系的温度及加热时间的探讨图1酶活性随温度的变化T由上图可.知，在温度为45摄氏度左右时，植酸酶的活性达到最大，所以在酶促反应时应使 温度稳定在45C左右，植酸酶的作用效率才最大。2、反应溶液pH的探讨图图2酶活性随pH变化200180200180160140120A 1008060402000 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6

2、 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10pH由上图可知，在PH为5左右时，植酸酶的活性达到最大，所以植酸酶缓冲液提供的的PH 环境应在5左右由上图可知，Ca离子和Na离子对酶的活性影响最小，Zn离子和Cu离子对酶的活性抑制影 响较大。图4离子浓度对酶的影响9080709080706050403020101009080706050 S403020100.841.061.682.122.523.184.25.38.410.6Con圆点系列表示+浓度对酶的活性的影响，随 Cu2+浓度增加，酶的活性增加： 三角形系列表示Zr?浓度对酶活性的影响，随着Zr?,浓度增加，酶的活性增加。4、不同反

3、应体系条件对植酸酶活性测定影响不同温度和pH下的酶比活性变化酶比活性酶比活性图5所示为正交实验时，不同温度和pH的组合的条件下测得的植酸酶的比活性，在pH为 5,温度在45C左右时植酸酶活性这到最大。5、酶促反应时间的确定37Phr由上图可知，在0.5h以前，酶作用底物的速度呈直线关系,所以测定时反应的时间应该在5、酶促反应时间的确定37Phr由上图可知，在0.5h以前，酶作用底物的速度呈直线关系,所以测定时反应的时间应该在30min左右。斜率=0.854523227相关性=0.997923599截距=3.383740831根据上图可求得Sm=2.53mmol/L7、酶的稳定性图8酶的稳定性2

4、50200空 150房遂 100500020406080100120140time由图可得，酶活性随时间而降低，故酶样品溶液需要现配现用三、实验步骤1、标准曲线的制作准确称取0.680g在105C烘至恒重的基准磷酸二氢钾（）于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲 液溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L按下表的比例用乙酸缓冲液稀释成不同的浓度， 与待测样一起反应测定。以无机磷酸的量为横坐标，吸光值为纵坐标，列出回归线方程（y=a+bx）o标准稀释比例标准溶液序号稀释量浓度/(|J mol/ml)10. 5-161. 562520. 5-83. 125030. 5-46. 250040. 5-

5、212. 500050. 5-125. 00002、取10ml试管按卜面的反应顺序进行操作，标准空白加Ao 2ml乙酸缓冲液。在反应过程 中，从加入底物溶液开始，向每只试管中加入试剂的时间间隔要一致，在恒温水浴45C水 解 SOmino3、反应步骤及试剂、溶液用量见表。反应顺序样品、标准样品空白1、加入乙酸缓冲液1.9ml1.9ml2、加入酶液0.1ml0.1ml3、混合VV4、恒温水浴45笆预热5|7!泊V5、依次加入植酸溶液4ml4ml （第二步）6、混合VV7、恒温水浴45C水解30minV8、依次加入终止及显色液4ml4ml （第一步）9、混合V总体积10ml10ml注：终止及显色液：

6、移取两份硝酸溶液（1+2水溶液），一份偏巩酸氨溶液混合后使用， 现用现配。乙酸缓冲液,c=0.25mol/L:称取20.52g无水乙酸钠于1000ml烧杯中,加入900ml水搅 拌溶解至刻度。4、样品测定反应后的溶液在室温下静置lOmin,如出现浑浊需在离心机上离心去沉淀，上 清以磷酸标准曲线空白调零，在分光光度计415波长处测定试样空白（A。）和是试样溶液（A） 吸光值，A-AO为实测吸光度值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。四、结果计算和表示1、植酸酶活性单位的定义由己知的条件:植酸酶样品在植酸钠浓度为5.0 mmol/L、温度45C、pH值5的条件下, 每Imin从2.5mmol/L植酸钠中释放Ip mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以“U”表示。(1)式中：X一一试样中植酸酶的活性，单位为酶活性单位每克（U/g）或酶活性单位每亳升（U/ml）; y一一根据实际试样的吸光值由直线回归方程计算出无机磷