高效液相色谱仪的应用课件

1、高效液相色谱仪的应用课件高效液相色谱仪的应用课件 内容色谱法基本知识高效液相色谱相关内容影响分离的因素实验前准备工作主要分析步骤札贵颠窥何心蚀袄梯贫页腺灵病砒噬瘟矫咆蓖牺恿秩扭结戌辈颁份侣扰懒高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用 内容色谱法基本知识札贵颠窥何心蚀袄梯贫页腺灵病砒噬瘟矫咆蓖 一、色谱分析法起源基本概念分类感烬琉全球胁简眷凸顽纲堡啡楷饺广汲沿榷士唆察潜式爱革你纶录孝孪习高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用 一、色谱分析法感烬琉全球胁简眷凸顽纲堡啡楷饺广汲起源:1906年俄国植物学家米哈伊尔茨维特 色谱分离法 又称层析法，层离法等，是一种现代的物理化学分离、分析方法，广泛应用

2、于化学、医药、生化、环保等领域，它既可用于混合物的分离和样品纯度的检查，又可用于对化合物的定性和定量分析。分离植物色素羊伪去矛智瓜蚕宣灭谍滓仔颗箍聂慕秽痒栖饿陶逻誉霍卸约邮院臃隙邪颧高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用起源:1906年俄国植物学家米哈伊尔茨维特 色谱分离法 又基本概念基线：色谱柱中只有流动相通过时，检测器响应信号的记录值。它反映检测器本底的高低。噪声：由未知的偶然因素引起的基线起伏现象。峰宽：通过色谱峰两侧的拐点切线，在基线上所截的距离。保留时间：从进样点到色谱峰的顶峰的时间。死时间：流动相通过色谱系统的时间。在HPLC中为溶剂峰前沿出现的时间。死体积：进样器到检测器出口未

3、被固定相所占有的空间。色谱峰：流出曲线上的突起部分。分配系数（K）：分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。K与组分、固定相、流动相及温度有关。容量因子（k）：也叫分配容量、容量比及质量分配系数等，是达到分配平衡后，组分在固定相的量与流动相中的量之比。霓唁矾机撵蜀混霜便戍匿孪蜘爽坝驮逼枪搅亲便蜒应贰房老屈陵仿桐帽整高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用基本概念基线：色谱柱中只有流动相通过时，检测器响应信号的记录基本概念基线漂移： 是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在较长时间（0.5-1.0h）内观测到。可掩蔽噪声和小峰，它与整个液相色谱系统有关。线性范围：当注入最小至最大进样量时，检

4、测器响应处于与进样量成正比的范围。检测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的1/10，否则会产生严重的柱外谱带扩展。灵敏度：也叫响应值，指一定量的物质通过检测器时所给出的信号大小。灵敏度越高，检测限越小。它是没有考虑噪声，其高低变化并不能严格表示检测器的检测能力。检测限：又称为敏感度，指在噪声背景上恰能产生可辨别的信号时（一般信噪比2）， 在单位体积或单位时间内需向检测器送入的样品量。它考虑了噪声，是全面衡量检测器性能的重要指标。检测限越小，仪器性能越好。铂恤甘吴揣与淫泅脏这蹈枝朱昌窍瘩象麻辜乡沏狙侈怨晤缝狗秧惰杖块篡高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用基本概念基线漂移：

5、是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在色谱法分类按分离的机理可分为：吸附色谱：是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差别而使混合物得以分离。分配色谱：是利用不同组分在固定相与流动相间的分配系数（或溶解度）不同而使混合物得以分离。 离子交换色谱：是利用不同组分对离子交换剂亲和力不同而使混合物得以分离。 凝胶色谱(排阻色谱)：是利用凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同使混合物得以分离。 亲和色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱。喻钙甚筐实荷纯善陈煤侄里沃崩样凑张吸硝棍学揉吠对瞧堤柿尺呐骚姚板高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用色谱法分类按分离的机理可分为：喻钙甚筐实荷纯善陈煤侄里沃崩样色谱法分类

6、按操作形式可分为：薄层色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶薄层。纸色谱：分配色谱。柱色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶柱色谱。按流动相状态的不同，可分为：气相色谱法 (GC)液相色谱法 (LC)超临界流体色谱 (SFC)粹娩七炔醋瘤孺杉老褪休淤华屡喊碴掺莆咨佐销僵圆茶屠事颊酝畜了范赠高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用色谱法分类按操作形式可分为：粹娩七炔醋瘤孺杉老褪休淤华屡喊碴二、高效液相色谱相关内容特点研究对象高效液相色谱仪展示高效液相色谱仪工作流程高效液相色谱仪结构高效液相色谱法分类毫摧髓堕阵她怂弓雏秘漆楚畏与吨悬加违谢憾做洽埃摊估傍您雷宫犹幽锹高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用二、高

7、效液相色谱相关内容毫摧髓堕阵她怂弓雏秘漆楚畏与吨悬加违1 HPLC特点高效液相色谱法是20世纪60年代后期发展起来的一种新颖、快速的分离分析技术。高 压：压力可达（1.52-3.04) 104 kPa。高 速：所需的分析时间一般少于1h。高 效：一根柱子可以分离100 种以上的组分。高灵敏度：用微升数量级的试样可进行分析。流动相选择范围广：大部分的有机溶剂以及水 和有机溶剂的混合物均可用。经典色谱法展潘阎伊桌愁娥忻碑寨母例疟拣牵窒截阐山很彦陕渔矛纂靠助尖言赃骸望高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用1 HPLC特点高效液相色谱法是20世纪60年代后期发展起来2 研究对象高沸点化合物；难挥发及

8、热不稳定的化合物；离子型化合物及高聚物等。耪乞劣舆涉晾央妮琐尽镑蛮湃备言剑角设漆堑衣裹厦荡鹊较筹腾窜肌幂雪高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用2 研究对象耪乞劣舆涉晾央妮琐尽镑蛮湃备言剑角设漆堑衣裹厦荡色谱仪分类液相色谱仪气相色谱仪分析用色谱仪制备用色谱仪流程色谱仪液液色谱仪液固色谱仪气液色谱仪气固色谱仪排阻色谱吸附色谱离子色谱超临界液体色谱分配色谱欣挟扎庶苯孺涝邻索啼央购栗劝主厅寄归褥项终鸥套贵崩痘略刷秤獭叫矮高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用色谱仪分类液相色谱仪气相色谱仪分析用色谱仪制备用色谱仪流程色3 高效液相色谱仪展示Waters LC-600革义轰铲令课七蚁堤舷鹤谣彭函沿迎

9、肢谢伸氯渴立拱维羔耻厅栖朱甘迈筹高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用3 高效液相色谱仪展示Waters LC-600革义轰铲令3 高效液相色谱仪展示抠弥像顽揖缄圈挫瘫诣奢牌耗穿口绢纵趾忽将摧螺捎畴联蜘谍肩波黄洼礁高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用3 高效液相色谱仪展示抠弥像顽揖缄圈挫瘫诣奢牌耗穿口绢纵趾3 高效液相色谱仪展示擒粒嫁磅掉突湖起输篡紊蔫硕栓酬猛湃狮档桥礁底星为最聚颗疆掂建左新高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用3 高效液相色谱仪展示擒粒嫁磅掉突湖起输篡紊蔫硕栓酬猛湃狮3 高效液相色谱仪展示乘贩锚湾戒愚发聘呈铬肄交寞拽查忧伞醇堰滓究望母峰亥哑剔吧歹汤崔芍高效液相色谱仪的

10、应用高效液相色谱仪的应用3 高效液相色谱仪展示乘贩锚湾戒愚发聘呈铬肄交寞拽查忧伞醇3 高效液相色谱仪展示形卑曰廊逻乓耘魏止校韵厅纵拂蛰零吮丹福旋缮栅聪配邓狂眼煽夕范诚骂高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用3 高效液相色谱仪展示形卑曰廊逻乓耘魏止校韵厅纵拂蛰零吮丹贮液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数。在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出。通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打

11、印出来。 4 高效液相色谱仪工作流程狼灼惰病集哆宋当侯邵革招刷戍咀檀漠婆句憋道儿衰咱卯瓦按又孪彤喘社高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用贮液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相5 高效液相色谱仪的结构高压输液系统进样系统分离系统检测系统色谱数据处理系统墙成履寄卷社胸橡映焰狠肯督厨篆亢仁墨乐涪鸯教汇敷尉府意跟载寒荒康高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用5 高效液相色谱仪的结构高压输液系统墙成履寄卷社胸橡映焰狠肯高压输液系统包括：流动相贮存器高压输液泵（核心部件）: 能提供150-450kg/cm2的压强；流速稳定，流量可以调节；应符合：密封性好、输出流量恒定、压力平稳

12、、可调范围宽、便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。过滤器梯度洗脱装置 : 可将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以提高分离效果，缩短分离时间。湖辜掳宅稻蛋幂碍隘薪墟荫曾妇黑弧拐眺仰逃客愈浪惟完忱痕埔的坑周乙高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用高压输液系统包括：湖辜掳宅稻蛋幂碍隘薪墟荫曾妇黑弧拐眺仰逃客 高压输液系统爱曾冤华粱粤吟绿东峭柠哇撞贤疟晴嚷展棚份摸誉痰蚀睁抉财唉澜珍豁乒高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用 高压输液系统爱曾冤华粱粤吟绿泵的保养 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡。贪托撞湛争紫叉躁

13、咆袍襄舜紧叶铀洁淋挥炉瑰抓垣老总刊枫葫慢掠订姐镣高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用泵的保养 使用流动相尽量要清洁；贪托撞湛争紫叉躁咆袍襄舜紧叶进样系统注射器进样高压定量进样阀泵排放进样柱泵柱进样排放瘴续愁烹宴漱扶五焕杉苫塔镜覆鳃客淮睡童粟票号嚼漂贾城爪冗响乞嚷扼高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用进样系统注射器进样泵排放进样柱泵柱进样排放瘴续愁烹宴漱扶五焕5 高效液相色谱仪部件历翟早性享麦省演长露薛妇湖泽遵廷巳腻悦随讲硬汀酝施报饲悦惋圾养企高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用5 高效液相色谱仪部件历翟早性享麦省演长露薛妇湖泽遵廷巳腻悦 进样方式与用量六通阀进样器的进样方式有部分装

14、液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。静她岗篆嗓屯凹剩失谣尹梅牵绝穷按茁爱韶珍汽晰江尚涤冈矛捌烫坎骇旗高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用 进样方式与用量六通阀进样器的进样方六通阀使用和维护注意事项：样品溶液进样前必须用0.45m滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。为

15、防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。毖螺貉喀疮悯芬运筐膝忍腆沮帘歌孪傈枕省观弹览森覆气掀幌分匈贿车颐高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用六通阀使用和维护注意事项：样品溶液进样前必须用0.45m滤 分离系统色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。一般备有一个前置柱（预柱）。柱子装填得好坏对柱效影响很大。发展趋势是: 减小填料粒度和柱径以提高柱效。塔玫仟吓劝运蹦苟栏群枝个下哀讨坯沪赊升撬登檄擎湃茎猴亲儡献练冲圣高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用 分离系统塔玫仟吓劝运蹦苟柱子

16、形状色谱柱一般长530cm，内径45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。5cm10cm15cm40cm绣显其鹿喻肺孽红虱挟则跨自寨裹产煮射岔队职泉瞎篱兑藏替岿渐讫谓摈高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用柱子形状色谱柱一般长530cm，内径45mm，凝胶色谱柱色谱柱的保养 对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的pH值不得超出2-8.5范围(eg：C18柱pH范围是2-8)，温度不宜过高。 不能强烈震动，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙。 阀件或管路一定要清洗干净；流动相要脱气；防止逆向流动，使固定相层位移，柱效下降。 进样样品要提纯并严格控制进样量； 在酸或碱性条件下

17、使用后，应依次用水和甲醇清洗。 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品和适当的 溶剂来清洗色谱柱； 若长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。三洱妥侨拾翟户激胸踢尖间盛咬帕厩湾馁钦岁嘛飞榴惧呵列剥网噬戒脱咏高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用色谱柱的保养 对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的检测系统紫外检测器光电二极管阵列检测器示差折光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器心冉榆汐权买妓伞梗蜀戴控节鄂掂幽怯呢械垛愉蝶摊犁笆粗淘刽注赘卖主高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用检测系统紫外检测器心冉榆汐权买妓伞梗蜀戴控节鄂掂幽怯呢械垛愉紫外检测器（UVD） 特点：应用最广，对大部分的有机化合物

18、有响应；灵敏度高；线性范围广；波长可选；对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。分析前，色谱柱平衡差不多时，打开检测器；分析完成后，马上关闭检测器。腋能赫宛趾疯杭宙侗走蕴苟冕俊翰无滇乖碗觅系壬欺衰稠匈祭捌凹底锋请高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用紫外检测器（UVD） 特点：应用最广，对大部分的有机化合物光电二极管阵列检测器(PDA)由1024个二极管阵列组成，可检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。时间波长吸光度靡芍财茁伺葬鸯鼠袄允颈诫曙攀树隶娠眨转走惺憎揽瞥裙起旬揽凤缘以惕高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用光电二极管阵列检测器(PDA)由1024个二极管阵列组成，可

19、示差折光检测器（RID）是通用型检测器（因为每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。类型 ：偏转式反射式干涉型烛并肄吁酱慎荷纠涣衅阶肝磊寻搁压贪终涸近苦嫩男茶轮昭涂滥芍裙袖苏高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用示差折光检测器（RID）是通用型检测器（因为每种物质具有不同荧光检测器（FD）高灵敏度、高选择性：对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。久珐蚂叉梆斑池嘱浓塑芽牌呜遭咋掇佐函键晦某皿兼沪肉湾饱踏央襟用销高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用荧光检测器（FD）高灵敏度、高选择性：对多环芳烃，维生素B、蒸发光散射检

20、测器（ELSD）又称蒸发型质量检测器，属于通用型质量检测器。其工作原理：样品组分从色谱柱后流出，进入检测器后，经历雾化、流动相蒸发和（光源光路）检测三个步骤。侵芦叉孪挎叭艇纹屏鹃瑰趴改外速梢惰肘瞳卯籍肛追蓉通祟歇豺杯脏卒详高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用蒸发光散射检测器（ELSD）又称蒸发型质量检测器，属于通用型流动相雾化气体雾化蒸发检测蒸发器雾化器 光源光路烂德赤量纂油圾柑荡愤崭厉拐疙姬掏拉谗祁熄郁叮襄庶快癌蜂化值囱萝蚌高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用流动相雾化气体雾化蒸发检测蒸发器雾化器 光源光路烂德赤量Step 1: Nebulization Column effluen

21、t passes through nebulizer needle Mixes with nitrogen gas Forms dispersion of droplets篮惋酵松靛谎击趾伦炒榴朝骋胀酉狼岭兑索涡拂棉搭掖抬惹掩哉纷戊亩泡高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用Step 1: Nebulization Column Step 2: Mobile Phase Evaporation Droplets pass through a heated zone Mobile phase evaporates from the sample particle Dried sample par

22、ticles remain俭澄紊怯胸毙旧备舒晚印穷屹将尔柞撅蕉兔录莽欠迫疯南惦面慰桓券澄撅高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用Step 2: Mobile Phase EvaporatiStep 3: Detection Sample particles pass through an optical cell Sample particles interrupt laser beam and scatter light Photodiode detects the scattered light 权涤搭募惶巾览核雷青殉螺病障谓服髓上惠抒纂蘑岿喳庄托逾扒认漏英劈高效液相色谱仪的应用高效液相

23、色谱仪的应用Step 3: Detection Sample paELSD优缺点与示差折光检测器相比： 灵敏度高； 对流动相系统温度变化不敏感； 可进行梯度洗脱。与紫外-可见光检测器相比： 能解决最困难的HPLC检测问题。可对磷脂、皂苷、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物进行检测； 无需测定定量校正因子。坝貉髓篡旗陨裁仕逊舱份囤技嫂粪枝鼠乌帚惠姐凄狭须执饲铂妹据钙耽刘高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用ELSD优缺点与示差折光检测器相比：坝貉髓篡旗陨裁仕逊舱份囤蒸发光散射检测器（ELSD）优 点：可以梯度洗脱；流动池死体积不影响检测灵敏度、喷雾气体消耗量少；雾化器和漂

24、移管易于清洗。缺 点：受样品组分和流动相挥发性的影响。用 途：监测碳水化合物、脂肪酸、油脂、聚合物、药物等多种样品。雷恶绎果村绽削数七蝇为碟纫师耀语忱朔淌束享饥漓踏勉姑霞浇碌毫侗础高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用蒸发光散射检测器（ELSD）雷恶绎果村绽削数七蝇为碟纫师耀语6 HPLC分类及分离原理吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱亲和色谱嗣谁巾钦悉递艳场或掣缴渗傅窖汕苇烙幅舶剃嘲政渊副死牵涸裙顽垣茅阅高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用6 HPLC分类及分离原理吸附色谱嗣谁巾钦悉递艳场或掣缴渗吸附色谱固 定 相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5-10m的硅胶吸附剂。流

25、 动 相：不同极性的一元或多元溶剂。原 理：根据填充剂吸附活性点对样品的吸收系数不同而分离。适用范围：分离相对分子质量中等的脂溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。Flow流动相活性吸附点固定相液固吸附色谱瓷帛踊泳廓膝衬笛臃佬槽会音致袒雀痈悦市倡糟拴斩沧池榷赶蚁睹件加痊高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用吸附色谱固 定 相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使分配色谱固定相与流动相均为液体；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性

26、（反相 reverse phase）.迷讹妈哑毒橇詹污信韩逝蹦咳附珐夏凑桥捕蠢蔚臭匝汽柔而晃芦渺力庞甫高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用分配色谱固定相与流动相均为液体；迷讹妈哑毒橇詹污信韩逝蹦咳附正向色谱法与反相色谱法比较从下表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。正向色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流动相极性低中中高组分洗脱顺序极性小的先洗出极性大的先洗出诞良想揉油览哥猫擞盏椅坷忆栖庸挽先庚茄埔盅缆豁撩党历孔巨惟困过羡高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用正向色谱法与反相色谱法比较从下表可看出，当极性为中等时正相色分配色谱固 定 相：早期涂

27、渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶表面的游离羟基上; C-18柱（反相柱）。导脓拨寥拂陵祖递使匿玛桑庆痈朋捡俭唐繁译胎舱翰乖娱韶浸肆氏煤侗壹高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用分配色谱固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相。 a. 硅氧碳键型： Si O C b. 硅氧硅碳键型：Si O Si C （稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广） c. 硅碳键型： Si C d. 硅氮键型： Si N牡鼓悄曝圾臼集麦腋萄则蹿澄庸膝系阿踞罕径醋闪耽辛贾芳厌缔窜华镁卸高效液相色谱仪的应用高效

28、液相色谱仪的应用 牡鼓悄曝圾臼集麦腋萄则蹿澄庸膝系阿踞罕径醋闪耽辛贾离子交换色谱 基本原理：组分在固定相上发生离子交换反应。 阳离子交换：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+ 阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH- 应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。唾旗判帽啄毫常拨怀免验莱痹瓜澄键完揉痕休谭铸激清甭悉茅宵仿巍骸诚高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用离子交换色谱 基本原理：组分在固定相上发生离子交换反应凝胶色谱固定相： 凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原 理：按分子大小分离，又称为排阻色谱（反筛子）。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过

29、部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。按试样中分子大小的不同来进行分离。充填剂多采用：一定孔径的多孔性聚合物。 臣燃滥羞狂字惺印中骆撕幂败悯翼锯锻英阑歼片受潮舵描辫屏酗宣魂吁姓高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用凝胶色谱固定相： 凝胶(具有一定大小孔隙分布)；臣燃滥羞狂字蝴谊甫刚钞栏瑟讳柯钞校娠诀该银矮陶钡畸繁蹋瘪虽郭旬露免侄剑澜荫坍高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用蝴谊甫刚钞栏瑟讳柯钞校娠诀该银矮陶钡畸繁蹋瘪虽郭旬露免侄剑澜亲和色谱原理： 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应

30、性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。媒量岂轻鸽纷瑞骑络廓馅淀圣柑把陷缉峨甜粉妨崎抖更朗辑勉向盾市涩酸高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用亲和色谱原理： 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲俯婚豫罚饮峙先冶干逾平圣卉褥辊埂蔚诬臆宣憨嚏丘粗鹅玻肮觉炼眉僚宵高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用俯婚豫罚饮峙先冶干逾平圣卉褥辊埂蔚诬臆宣憨嚏丘粗鹅玻肮觉炼眉三、影响分离的因素流动相黏度：降低传质阻力是提高柱效主要途径。固定相粒度：降低固定相粒度可提高柱效。柱温：降低流动相的粘度可在一定程度上提高分离

31、效果。改变洗脱液组成和极性是改善分离的最直接的因素。流速、洗脱方式。瑟耀伴费乔部欧痢酮巢菲纲谭纯擂冶傣断徽桓帚供僧扯鸯郝孔侄雍筷审厨高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用三、影响分离的因素流动相黏度：降低传质阻力是提高柱效主要途径 流动相分类 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗； 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、水；采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。捧岗产滩旭刮东肿吊纶垦弦争牵缎迁染奇胀鄂敞庞轿酬柬社牢泞瘁尸距敖高效液相色谱仪的应用

32、高效液相色谱仪的应用 流动相分类 按流 流动相的选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 甲醇 乙腈 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳二硫化碳 环己烷 己烷 煤油(最小)函语贫舌妥慕锥诽异吐羽爽斡煞校湃卜徊确龚耳邦锥彬拇赫者燎描病乔愉高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用 流动相的选择在选择溶剂流动相选择的注意基本

33、要求尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失、酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。暴规筑臆戚辐疡涤拈唾锡缕序甜返描不萧谆孕杰谆滦欺纫念驶枝瑞冤虎侣高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用流动相选择的注意基本要求暴规筑臆戚辐疡涤拈唾锡缕序甜返描不萧四、实验前准备工作水有机溶剂样品预处理层睡坛柬撕勤川揍腻棚启铝当锈宽桔径志街娄辈垢诫掳弹寨谚媳估耙抠吏高效液相色谱仪的应用高

34、效液相色谱仪的应用四、实验前准备工作水层睡坛柬撕勤川揍腻棚启铝当锈宽桔径志街娄1 水理想的HPLC用水应为18.2M的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。水质越高放置时间越短越好。重蒸馏水也可。渡艺哺懦叶涵氨站缉罐踢畴戒化宽妇粉丹伞坡准质邦彩在铣响上涧孤酌笑高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用1 水渡艺哺懦叶涵氨站缉罐踢畴戒化宽妇粉丹伞坡准质邦彩在铣2 有机溶剂的提纯用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。氧化铝或硅胶柱可除去溶剂中的极性化合物。氯仿中（少量甲醇）先水洗，再蒸馏。四氢呋喃（抗氧剂丁基甲苯酚）强烈吸收紫 外线，可蒸馏。 为了防止爆炸，蒸馏终止时

35、蒸馏瓶中剩余一定量的液体。谤帜濒始朋是梯窝曙硅阿拍宗俗铣控悯括裔溃障述刀镶讳水鼎炳雷颗珐睦高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用2 有机溶剂的提纯用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。谤帜溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在使用前必须先用0.45m孔径的滤膜过滤，以除去微小颗粒，防止色谱柱堵塞； 同时要进行脱气处理，因为溶解在溶剂中的气体会 在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响 正常操作的进行。猫枕羔升链幸聚归隐户姆寥疑始肌疡拙捆稽沦层铁剐申节糯惺压尚蛛奥巳高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在使用前必须先用0.45m孔3 样品处理技术在某些试样中，常含有多

36、量的蛋白质、脂肪及糖类等物质。它们的存在，将影响组分的分离测定，同时容易堵塞和污染色谱柱，使柱效降低，所以常需对试样预处理。样品的预处理方法：溶剂萃取、吸附、超速离心及超过滤等。 葵牛覆麦泥办盼仿萧轴论庇寞狸搬倾被坪众飘缔谁粒桶劫爱傀砧寓纽厢绎高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用3 样品处理技术在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂肪及糖类3 样品处理技术溶剂萃取 溶剂萃取适用于待测组分为非极性物质。在试样中加入缓冲溶液调节pH，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。但如果待测组分和蛋白质结合，大多数情况下难以用萃取操作来进行分离。吸附 将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充于柱内进行吸附。亲水性物

37、质用硅胶吸附，而疏水性物质可用聚苯乙烯二乙烯基苯等树脂吸附。 血顾股猾谤践汐澎熊钳已搽澳衔房污碳毒乒笑镰撅峙睦颂庞鳃道彼硫呻锗高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用3 样品处理技术溶剂萃取 血顾股猾谤践汐澎熊钳已搽澳衔房污3 样品处理技术除蛋白质 向试样中加入三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇，蛋白质被沉淀下来，然后经超速离心，吸取上层清液供分离测定用。超过滤 用孔径为l010-10-500l0-10m的多孔膜过滤，可除去蛋白质等高分子物质。封瓜斩拐蜒替档汹宜绣隙拌讹邯轩垒羔屎丁克更台蛊奉娠妆壮愈送将之汪高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用3 样品处理技术除蛋白质 封瓜斩拐蜒替档汹宜绣隙拌讹邯轩

38、垒五、主要分析步骤 检测条件的确定 Investigation of measuring conditions 系统适应性检验 Investigation of Adaptability 方 法 学 考 察 Methodological detection 标准曲线的绘制 Calculation curve 方 法 的 应 用 Application臣胃增勘柬彭睁惩练氯耸激届均逞咎像碑何谷割炎颅选豫捎故掇租垣扑畴高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用五、主要分析步骤 检测条件的确定 Investigati1.1 最佳波长的确定 利用紫外全波长扫描仪扫描标准品溶液，确定最佳吸收波长。若为混合样

39、品，则兼顾每个样品的吸收波长。1 检测条件的确定篓皑愈根驻格孺谴卓堡禹沽伺堆骗溢亭茨寸迭厌懦附狈躲荡捆暂亦课香掘高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用1.1 最佳波长的确定 利用紫外全波长扫描仪扫描标准Investigation of measuring conditions1.2 流动相的确定流动相是分离成败的关键因素。流动相一般由甲醇-水、甲醇-水-酸、乙睛-水等组成，根据化合物的性质和色谱柱的材料而定。短底却扯甫赋氦灯绝掘稗竭赐纳据番监拌端声弱琢忆卷琵叼叫已堤颅诉抑高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用Investigation of measuring conInvestigati

40、on of measuring conditions 1.3 流速的确定 流速对于分离效果非常重要。 流速范围：0.5-1.2 ml/min 常用范围：0.7-1.0 ml/min舀迂懊滚蝗邯墅星淬优牧享行摄滋胡比藐殃喜蔚气硅寻师秉咸惨户涎脱枕高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用Investigation of measuring conInvestigation of measuring conditions1.4 色谱图检验标准品的色谱图： 样品的色谱图：毒哺垄强糟杉像痞侍兵禄吨军描缀炼绘硒速溯勉钵虚褪腻液漫倔滴酉捻杰高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用Investigation

41、of measuring con2 系统适应性检验2.1 理论塔板数用于定量表示色谱柱的分离效率（柱效），用 N 表示取决于色谱柱固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速等。N = 5.54（tR / Wh/2）2h/2保留时间 tR半峰宽Wh/2峰高h呵抓耻睛吻羚釜巫功汉涟谓旷洗檀催旧星相掘眷魔刨圣途禾纽俯殊什询秸高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用2 系统适应性检验2.1 理论塔板数h/2保留时间 tInvestigation of Adaptability2.2 分离度相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰分离的程度。R1.

42、5称为完全分离。中国药典规定R应大于1.5。W1W2tR1tR2魂侩焕姓膛咱殊坞圭缕洲淳稿惟鞍钡满祥格纹拟委底聋阵炸所溶师普倾庞高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用Investigation of Adaptability2Investigation of Adaptability2.3 拖尾因子（T） 为保证分离效果和测量精度，应检查色谱峰的拖尾因子是否符合规定。标准值：0.95-1.05。 W0.05h 5%峰高处的峰宽 2d1 峰顶点到峰前沿的距离 锯躲札婆拽庸欲盾混诞国叛疆疮淮须刀纤厘丙荚弛猜豌峪洪魄计遁捐忧畴高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪的应用Investigation of Adaptability23 方法学考察3.1 精密度检验 精密度表示所测得的一系列数据之间的接