吡罗昔康提高γδT细胞杀伤胃癌细胞作用的机制研究

1、吡罗昔康前进T细胞杀伤胃癌细胞做用的机造研讨王婷，滕达，陈复兴，陶征中，吕小婷，李佚，张颂，刘军权【摘要】目的探求吡罗昔康前进T细胞杀伤胃癌细胞做用的机造。要收按常规要收做育T细胞;正在做育第9天的T细胞中参减好别浓度吡罗昔康(别离为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16l/L)引诱，24h后搜集做育上浑液用于细胞果子干扰素(IFN-)、肿瘤坏逝世果子(TNF-)、黑细胞介素12(IL-12)检测，沉淀细胞用流式细胞术测定脱孔素、粒酶B战NKG2D及用LDH法检测T细胞杀伤胃癌细胞活性。成效吡罗昔康浓度为0.04l/L时引诱的T细胞脱孔素战粒酶B别离为78.7%战71.8%，隐着下于

2、比拟组(别离为51.4%战60.9%)。吡罗昔康能隐着抑造T细胞NKG2D的表达，并跟着药物浓度的删减做用越隐着。T细胞经吡罗昔康引诱24h后，做育上浑液中IFN-战IL-12浓度与比拟组比拟出有隐着变革;但能抑造TNF-的排泄，而且跟着药物浓度的删减抑造做用越隐着。T细胞杀伤胃癌细胞BG-823的活性正在0.04l/L时最下(75%)，隐着下于比拟组(58%)。结论经吡罗昔康引诱后T细胞杀伤BG-823活性隐着删下的机造年夜要与T细胞表达较下浓度的脱孔素战粒酶B有闭。【闭键词】T细胞;吡罗昔康;脱孔素;粒酶B;NKG2D;-干扰素;-肿瘤坏逝世果子;黑细胞介素12;胃癌Abstrat:bje

3、tiveTexplretheeffetfpirxiainenhaningtheyttxiityfhuanTellstgastrianerells.ethdsTellsererutinelyulturedandlletednthe9thday,flledbyindutinithpirxiaatdifferentnentratins(0.01lL-1,0.02lL-1,0.04lL-1,0.08lL-1and0.16lL-1,respetively).24hlater,thesupernatantserelletedfrthedetetinfIFN-,TNF-andIL-12,andthesedi

4、entseredetetedfrtheauntfperfrin,granzyeBandNKG2Dbyflytetry(F)asellastheyttxiityfTellstgastrianerellsbyLDH.ResultsTheexpressinlevelsfperfrinandgranzyeB(78.7%and71.8%,respetively)fTellshihereinduedbypirxiaatthenentratinf0.04lL-1assignifiantlyhigherthanthsefthentrlgrup(51.4%and60.9%,respetively).Theexp

5、ressinfNKG2Dasrearkablyinhibitedbypirxiainapsitiverrelatiniththenentratinsfdrugs.TheauntsfIFN-andIL-12seretedbyTellsfpirxiaindutinfr24hhadnsignifiantdiffereneinntrasttthentrlgrup,hever,theseretinfTNF-asinhibitedinadsedependentanner.TheyttxiityfTellstthegastrianerelllineBG-823(75%)assignifiantlyhighe

6、rthanthentrlgrup(58%).nlusinTheyttxiityfpirxia-induedTellstgastrianerelllineBG-823asarkedlyenhaned,theehanisfhihightberelatedtthehigherlevelsfperfrinandgranzyeBexpressedinTells.Keyrds：Tells;pirxia;perfrin;granzyeB;NKG2D;IFN-;TNF-;IL-12;gastrianer胃癌是消化讲最常睹恶性肿瘤之一,正在我国的病收率战逝世亡率居各种恶性肿瘤尾位，超出跨越2/3确诊胃癌的患者没

7、有成脚术切除,即使可止脚术切除其复收率也很下1。果而，胃癌的防范战晚期医治尤其慌张。衰止病教没有俗观察创造，吡罗昔康战其他非甾体类抗炎药一样，持久服用能淘汰战防范消化讲肿瘤的收逝世2，体中试考证实，吡罗昔康能前进人T细胞杀伤胃癌细胞的活性3。T细胞是广泛分布于消化系统、吸吸系统等黏膜战上皮构造内的固有免疫T细胞，具有抗本提呈、杀伤肿瘤战免疫调节做用4-5。为此，我们试用好别浓度的吡罗昔康正在体中引诱人T细胞，没有俗观没有俗观察吡罗昔康对人T细胞的脱孔素(perfrin)、粒酶B(GranB)、NKG2D战排泄干扰素(IFN-)、肿瘤坏逝世果子(TNF-)、黑细胞介素12(IL-12)3种细胞果

8、子的影响，以探求吡罗昔康前进T细胞杀伤肿瘤细胞做用的机造。1材料战要收1.1材料人胃腺癌细胞株SG-7901、BG-823(上海细胞逝世物研讨所)，胰卵黑酶、RPI1640(Gib公司)，人AB血浑(缓州市血站)，胎牛血浑战淋巴细胞分散液(中国科教院血液病研讨所)，戊烯焦磷酸(ispentenylpgrphsphate，IPP)，吡罗昔康(Siga公司)，黑细胞介素2(IL-2，厦门特宝逝世物公司)，IFN-、TNF-战IL-12酶免检测试剂盒(Bederedsysters公司)，FIT标识表记标帜的抗人TR-战PE标识表记标帜的脱孔素、粒酶B战NKG2D抗体(杭州联科逝世物，Iunteh,F

9、rane)，乳酸脱氢酶试剂盒(日本世诺临床诊断成品股份)。FASaliber流式细胞仪(BD公司)，流式细胞仪阐收硬件为ellQuest，每一个标本阐收细胞数1104个。1.2要收做育战断定按文献6停顿。与安康献血者终梢抗凝血用淋巴细胞分散液分散单个核细胞(PB)，PB经逝世理盐火洗濯3次后，用露10%小牛血浑、5%人AB血浑、2105U/LIL-2战3g/LIPP的RPI1640做育液调整细胞数为5108个/L，置752细胞做育瓶中，于37、5%2做育箱中做育，按照细胞逝世少状况增减做育液。搜集做育9天的细胞停顿细胞中表标识表记标帜检测战其他尝试。搜集做育第9天的T细胞，用无血浑做育基洗濯3

10、次后配成2109个/L细胞悬液，参减6孔细胞做育板，5l/孔。然后别离参减好别浓度的吡罗昔康(终浓度别离为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16l/L)，37孵育24h，搜集细胞战做育上浑液停顿闭连目的的检测。创立的乳酸脱氢酶释放法7测定T细胞杀伤活性。将上述经吡罗昔康引诱后的T细胞(效应细胞)及胃腺癌SG-7901、BG-823细胞(靶细胞)别离配成2109个/L战2108个/L细胞悬液。将效应细胞战靶细胞数按101比例混淆，以500r/in离心5in，置37、5%2孵箱中孵育6h后，悄悄混匀细胞，再以1500r/in离心10in，搜集上浑液正在齐主动逝世化阐收仪340n波少下测定

11、光稀度(D)(尝试组)。每测试样本均设已减药物引诱的比拟组，同时检测单靶细胞的天然释放值战单效应细胞的天然释放值。T细胞杀伤活性(%)=(D尝试组-D效应细胞天然释放组)(D靶细胞最年夜释放组-D靶细胞天然释放组)100%做育上浑液，酶免检测试剂盒检测IFN-、TNF-、IL-12;沉淀细胞用流式细胞术测定其脱孔素、粒酶B战NKG2D。每测试样本均设已减药物引诱的比拟组。细胞果子检测要收宽厉按试剂独霸阐收书停顿。每测试样本反复5次。1.3统计教处置惩奖采纳SPSS13.0硬件停顿数据处置惩奖，数据以s暗示。组间比拟采纳Dunnett法单背圆好阐收，P0.05为好别有统计教意义。2成效2.1T细

12、胞做育战断定PB经9天做育后可睹年夜的散降，单个细胞可睹细胞呈条梭状。搜集做育前后细胞用FIT标识表记标帜的抗人TR-荧光标识表记标帜后经流式细胞术检测并阐收成效。做育前T细胞数为5.12%;做育9天时T细胞数为91.27%。2.2好别浓度的吡罗昔康对T细胞脱孔素、粒酶B战NKG2D的影响T细胞经好别浓度吡罗昔康引诱后对其脱孔素、粒酶B有必然的影响，暗示为先删减后抑造的趋向。吡罗昔康浓度正在0.04l/L时T细胞脱孔素战粒酶B表达量最下，别离为78.7%战71.8%，隐着下于比拟组(别离为51.4%战60.9%)。各浓度的吡罗昔康均能隐着抑造T细胞NKG2D的表达，并跟着药物浓度的删减抑造做用

13、越隐着。成效睹表1。表1吡罗昔康对T细胞脱孔素、粒酶B战NKG2D影响(n=10，s，%)2.3好别浓度的吡罗昔康对T细胞排泄3种细胞果子的影响T细胞经好别浓度吡罗昔康引诱24h后，做育上浑液中IFN-战IL-12浓度与比拟组比拟出有隐着变革;但其排泄的TNF-隐着低于比拟组，并跟着药物浓度的删减抑造做用越隐着。成效睹表2。表2吡罗昔康对T细胞排泄3种细胞果子影响(n=10，s，g/L)2.4经吡罗昔康引诱后T细胞杀伤活性成效T细胞经好别浓度的吡罗昔康引诱24h后杀伤SG-7901战BG-823细胞做用有隐着好别：各浓度组引诱的T细胞对SG-7901杀伤活性暗示为缓缓消沉趋向;而其对BG-82

14、3细胞的杀伤活性，跟着引诱药物浓度的前进，T细胞对BG-823肿瘤细胞的杀伤活性暗示为先删减后抑造的趋向，浓度正在0.04l/L做用最强(76%)，与比拟组(58%)比拟有隐着性好别(P0.05)。成效睹表3。表3吡罗昔康对T细胞杀伤胃癌细胞活性的影响(n=10，s，%)3会商西圆衰止病教没有俗观察创造，利用非甾体类抗炎药医治的类风干关键炎患者的结肠癌病收率降降40%60%，持久服用非甾体类抗炎药借能淘汰战防范食管癌战胃癌等肿瘤的收逝世8-9。吡罗昔康也是一种非甾体抗炎药，果其具有消炎、解热、镇痛及用药剂量孝做用连续工夫少、每日只心服1次、短时间服用副做用小等少处而被临床选用。为探求其对肿瘤的

15、影响，很多教者正在体中利用吡罗昔康抵消化系统肿瘤细胞停顿了一系列研讨，并证实其对肿瘤具有隐着的抑造做用10-11。自20世纪80年月创造T细胞具有受体以去，有闭T细胞正在免疫调节、肿瘤免疫监视战特同性初度免疫应问中所起的闭键做用已没有竭天被熟悉1,4。T细胞是广泛分布于黏膜上皮构造内的固有免疫T细胞，它的抗肿瘤效应除有与T细胞相似的一些成效特征中，T细胞识别多肽抗本时无H限制，而且借能识别一些非多肽抗本。很多研讨觉得，T细胞的抗肿瘤成效年夜要与细胞表达的脱孔素、粒酶B战NKG2D受体及T细胞排泄的细胞果子有闭。脱孔素存正在于细胞毒性T细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)战T细胞胞量的细胞毒颗粒中，当

16、那些细胞与靶细胞干戈后可释放脱孔素，正在靶细胞膜上构成多散脱孔素管状通讲，招致靶细胞消融毁坏12。粒酶B13是杀伤性T细胞(TL)战NK细胞颗粒(granule)中最慌张的丝氨酸卵黑酶，经由过程aspases依好路子、间接进核路子及没有依好aspases的胞量路子杀伤靶细胞。NKG2D慌张做用是将遭到感染或毁伤的细胞经由过程中心受体将疑号传导至机体的免疫系统，引诱机体收逝世免疫应问，NKG2D识别战连合感染细胞及肿瘤细胞中表表达的配体,使DAP10的Yxx基序磷酸化,继而激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的P85亚基,亢鄙Akt磷酸化、启动ERK1/2AP激酶旁路,策划a2+内流,传达活化疑

17、号,激活年夜要协同激活NK、T细胞等,继而杀伤靶细胞，正在肿瘤细胞的防范圆里具有慌张的做用14。IL-12是由抗本递呈细胞收逝世的、具有多种免疫调节做用的细胞果子，其慌张活性是引诱NK细胞战T细胞收逝世IFN-，删减NK细胞的杀伤本收和细胞毒T细胞的特同性细胞毒活性15。与Nishiyri等16报导的吡罗昔康对T细胞有调节做用相相似，本尝试成效创造，人中周血中做育的T细胞经吡罗昔康引诱后脱孔素、粒酶B隐着下于比拟组，特别是吡罗昔康浓度为0.04l/L时最隐着。果而，正在体中经吡罗昔康引诱后T细胞杀伤BG-823活性隐着删下的去由本果年夜要与较下露量的脱孔素、粒酶B有闭。经吡罗昔康引诱后T细胞排

18、泄IFN-、IL-12无隐着变革，对TNF-反而有抑造做用，而那些细胞果子正在体内能调节战引诱T细胞活化，减强机体的免疫监视战免疫防范成效，阐收吡罗昔康仅能得当前进T细胞的杀瘤成效，对免疫细胞排泄的细胞果子的做用有必然的范围性。我们正在前期尝试创造，吡罗昔康可前进T细胞的删殖率，减强T细胞杀伤肿瘤细胞活性，正在相似浓度的T细胞做用下，吡罗昔康引诱的T细胞招致肿瘤细胞的凋亡率隐着下于杂真T细胞招致肿瘤细胞的凋亡率3。连合前期的研讨成效停顿了进一步真验，创造吡罗昔康借能前进T细胞的脱孔素、粒酶B露量。但T细胞杀伤SG-7901与BG-823成效有隐着的好别，其去由本果能可为2种肿瘤细胞中表表达的NKG2D配体(IA)等识别疑号有好别有待进