甜叶菊糖甙的提取纯化及分离检测方法研究

1、甜叶菊(Steviarebaudiana)糖甙的提取纯化及分离检测方法的研究滕祥金摘要:随着人民生活水平的提高，现在吃得更营养，吃得更健康逐渐成为消费者关心的重点。甜叶菊糖甙的生产不但能补充我国食糖的不足，更可替代糖精等不利于人体的化学合成甜味剂，因此，低热量的甜味剂甜叶菊糖营也随之热起来，长期食用甜叶菊糖普不会使人发胖，特别适宜肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者使用，而且物理、化学性能稳定、无发酵性。本论文以本实验室栽种甜叶菊叶片为原料，研究并探讨了甜叶菊糖甙的提取、纯化、分离、检测的方法。蒸煮浸提法的最佳条件:以水为溶剂、温度100、时间6h、料液比1:10，浸提物中甜叶菊糖甙含

2、量为9.28%。甜叶菊糖甙的提纯通过比较选择了沉淀效果比较好的FeSO4；和Ca(0H)2，加入条件为80交换吸附精制甜叶菊糖甙，冷冻干燥后得到甜叶菊糖甙结晶粉末。甜叶菊糖甙组分的分离方法主要有重结晶法、层析法。重结晶法利用甜叶菊糖甙各主要组分在乙醇溶液中溶解度的不同进行结晶将主要组分分离;层析法是利用甜叶菊糖甙主要组分在装有硅胶的层析柱中被吸附和解吸速度的不同将甜叶菊糖普主要组分分离。检测甜叶菊糖甙含量的主要方法有重量测定法、液相色谱法、薄板层析法、分光光度法(蒽酮为显色剂)、分光光度法(DNS试剂为显色剂)、化学发光法等。采用硅胶G薄板层析法，展开体系:正丁醇:乙酸:乙醚:水(9:6:3:

3、l)，能十分清晰将甜叶菊糖甙、葡萄糖、麦芽糖分开，可以定性检测甜叶菊糖甙的两种主要单体组分。分光光度法(蒽酮为显色剂)和分光光度法(DNs试剂为显色剂)都可以测定甜叶菊糖甙的主要组分，方法简便，对实验设备要求不高，但准确度不高、误差大。流动注射化学发光法测定甜叶菊糖甙是我们最近研究出来的一种新的测定方法，能够准确测定出甜叶菊糖甙的含量，与其他测定甜叶菊糖甙的测定方法相比，其准确度、灵敏度都很高，这一测定方法在国内外尚属空白。具有一定的理论意义和实际应用价值。关键词:甜叶菊糖甙；提取；纯化；测定1前言1.1研究的目的与意义甜叶菊原产于巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脉，土壤条件是古代

4、水成岩及火成岩的风化土壤。呈现出明显的局部特异性土壤分布，多含沙壤土和腐殖质土，肥力较差。气候条件因地势及地形的原因，降雨量较多，温差较大，且有霜降现象，可认为近似温带气候，整个生长期温度都在20以上。甜叶菊具有喜温性，种子萌发的最适温度为20一25，营养生长期温度也要求22以上，开花的最适温度为18一22。甜叶菊属感光性强的短日照植物，临界夜长大于12h。长日照反应期分别在现蕾前13一14d和开花前2630d，此阶段为花芽形成诱导期。此时期需具备少于12h的短日照才能正常开花，所以短日照是甜叶菊由营养生长转到生殖生长的关键(鲍志华，1999)。甜叶菊作为糖料植物，早在第二次世界大战时就曾引起

5、过国际重视。1970年日本从巴西引进甜叶菊，开始驯化、栽培、制昔，同时进行毒理、食品检测等试验，并首先开发利用甜叶菊产品一甜叶菊糖甙。我国于1976年从日本引种试种，并获成功。目前除中国、日本引种和推广外，韩国、泰国、菲律宾等也有不同程度的推广栽培(T宁等2004，杨丹等2005)。我国自1976年开始由南京中山植物园、中国农业科学院等科研单位先后从日本引进甜叶菊试种成功。80年代初向全国各地推广种植，生产的甜叶菊干叶主要出口日本。1982年成都化学制药厂科技人员首次研制甜叶菊糖甙生产技术成功，紧接着，天津南开大学、北京商业机械化研究所分别在江苏镇江和湖南西湖农场兴建甜叶菊厂试产成功。1985

6、年卫生部批准甜叶菊糖甙在饮料、糕点和糖果中使用，而且用量不受限制，1996年我国甜叶菊糖甙产销量突破千吨大关(唐志发，1999)，1997年产销量达到1400吨左右，其中80%左右为出口，我国现已成为世界上最大的甜叶菊糖甙生产国和出口国。我国的甜叶菊糖甙发展之所以如此迅速，与其生产原料充足密切相关。甜叶菊适应性强，我国自海南到新疆，从云南到黑龙江，除高寒和无灌溉条件的地区外，均可种植，南方每年收成2一3次北方每年一收。事实证明，发展甜菊糖对我国国民经济发展有着重要的意义。甜叶菊糖营是由甜叶菊的叶片提取，是一种天然无热量高倍甜味剂，它在体内不参加代谢、不蓄积、无毒性，其安全性已得到国际FAO和W

7、HO等国际组织的认可，2004年7月6日世界联合卫生组织正式通过允许甜叶菊糖甙在世界范围内通用的决议，这为甜叶菊糖甙的安全性提出了有利的证明。因此，甜叶菊是一种安全的天然甜味剂。我国卫生部自1985年和1990年分别批准甜叶菊糖甙为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料，用其制成的食品饮料，长期食用不会使人发胖，特别适宜肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者使用，而且物理、化学性能稳定、无发酵性，可延长甜叶菊糖营制品的保质期。因而，被广泛应用在食品和药物行业中，被誉称为继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源(李钦等1994，沈秀丽等1995)，有着广泛的应用范围和宽阔的市场前景。现在吃得更

8、营养，吃得更健康逐渐成为消费者关心的重点。因此，低热量低脂肪的甜味剂甜叶菊糖甙也随之热起来，国内对甜叶菊糖甙的功能开发已初具规模，年产甜叶菊糖甙700多吨，不仅满足了国内市场的一部分需要，而且少量出口到世界其他国家和地区，所以甜叶菊糖甙有着广阔的市场前景，而提高产品质量、降低生产成本、从生产实际出发、简化提取分离纯化工艺是我们面临的重要课题。因此本文对甜叶菊糖甙的提取、纯化、分离、检测的试验方法进行研究讨论，探讨操作简便、灵敏度高、成本低的提取、纯化、分离、检测甜叶菊糖甙的方法。1.2国内外研究动态与趋势1.2.1国内外(日本)甜叶菊研究发展概况1970年开始，日本首先将甜叶菊从巴西引种，并且

9、从叶片中提取出甜菊糖的作为了甜味剂，在食品、药品等行业得到了广泛的应用。70年代起，日本、美国、韩国、巴西等国家先后进行过动物急性毒理、亚急性毒理、长期毒理学试验。日本药理学家明石和光桥(1978一1982年)数次反复试验，同时进行动物急毒、亚急性毒理、长期毒理学试验。结果表明，糖甙对动物没有任何毒害作用，且对肿瘤病变有控制作用，这是三萜类抑制亚硝铵再合成的作用所致，对人体代谢功能无任何不良影响。在对糖尿病病人的用量试验，未发现任何副作用，且对人体代谢功能无任何不良影响。St和RA的结构未发生变化即从体内排出，对动物无急毒性，同时也证明了对动物的生殖能力、变异性、遗传均不存在慢毒性。甜叶菊糖甙

10、作为食品添加剂被认可的巴西和日本使用已经有30多年的历史。截止到2004年底，日本申请产权保护的有4个品种，其中3个都己经保护期满，这些品种都不是转基因植物。甜叶菊的植物生物化学、栽培方法、病害等也进行了大量的研究。几十年的农业生产表明:在日本农业生产成本比较高。因此，目前的干燥甜叶菊叶片或粗糖甙产品儿乎来自于中国的黑龙江省、山东省、安徽省。日本甜叶菊糖甙的研究主要集中在北海道的东北大学农学部等7个单位;甜叶菊工业协会有10个公司参加。35年来，出版书籍近十部;发表论文近200篇;专利近20个。相对国外的甜叶菊糖甙的研究，我国起步较晚，研究进展缓慢，近期，郝再彬、胡献丽等学者先后对甜叶菊及其糖

11、甙的研究、发展、利用进行了大量的综述，表明了中国发展速度缓慢，各方面有待深入研究。在许多方面取得了一定的成绩，如:糖营提取方法及工艺研究;栽培技术及病害防治;离体培养及工厂化生产;糖甙的可见光检测、紫外线检测、化学发光检测;基因分析等。但是国内水平与国际相比差距很大。1.2.2甜叶菊的结构分布与理化性1.2.2.1甜叶菊糖甙的结构甜叶菊糖甙是从干燥后的甜叶菊叶片中提取出来的一类具甜味的萜烯类配糖体。目前为止，己从甜叶菊中分离得到8种不同甜度的糖甙。其中Stevioside是主要成分，占60%一70%，甜度为蔗糖的300倍;其次是RebaudiosideA，占15%一20%，甜度为蔗糖的450倍

12、，且甜味最接近蔗糖，其他组分含量都较少(舒世珍等1998)。甜叶菊叶片中含的甜味成分主要有八种(赵瑜藏等2000):(l) 甜叶菊糖甙(stevioside)(2) 甜叶菊醇双糖甙(steriolbioside)(3) 莱包迪甙A恤baudiosideA)(RA)(4) 莱包迪甙B(rebandiosideB)(RB)(5) 莱包迪甙e(rebaudiosideC)(RC)(6) 莱包迪甙D(rebaudiosideD)(RD)（7）莱包迪甙E(rebaudiosideE)(RE)(8) 杜尔可甙A(duleosioleA)(Dul-A)这些配糖体中含量高、且有经济价RA，不论从甜度和味质上均

13、受到好(totalstevfoside)表示甜叶菊总甙是表示莱包迪甙A结构式如图1:研究合适的纯化方法，分离去除其中的杂质(包括蛋白质、糖类、无机盐等)显得尤为必要。目前天然产物的纯化方法较多，主要有沉淀法、萃取法、酸碱法、吸附法、层析法和超临界C02流体萃取法等。本文采用沉淀法、吸附法研究了甜叶菊糖甙的纯化方法(刘宗林等2002)。沉淀法是加入一种沉淀剂和混合物中的杂质反应生成沉淀，过滤沉淀。因此采用沉淀法可以初步纯化甜叶菊糖甙(刘永宁，1993)。树脂吸附法是一种具有多孔立体结构的聚合物吸附剂，它是依靠其与被吸附分子之间的范德华引力，通过其巨大的比表面积进行物理吸附过程。1.2.5甜叶菊糖

14、甙的分离方法1.2.5.1层析法利用吸附剂对不同物质吸附能力的不同进行分离。由于甜叶菊糖甙各主要成份的极性存在细微差异，因此在层析柱中扩散的速度不同，利用这一点将各组分分开(沈秀丽等1995，陈天红等1998)。1.2.5.2重结晶法通过研究甜叶菊糖甙在甲醇一水混合液中溶解度的差异，采用较为简单的工艺技术将甜叶菊糖甙提取液经提取、脱色、吸附等处理后，再在一定配比的甲醇一水体系中重结晶，得到了RA含量高于60%的甜味剂产品，从根本上改进了甜叶菊糖的味质(张杨1998，刘宗林2002)。1.2.6甜叶菊糖甙的检测方法1.2.6.1薄板层析法薄板层析法是利用吸附剂对不同物质吸附能力的不同进行分离。由

15、于甜叶菊糖甙各主要成份的极性存在细微差异，在薄层上展开时，极性较强的糖甙如RA展开速度要慢一些，而极性弱的物质相对展开较快。再选用适宜的显色剂显色，定性鉴别甜叶菊糖甙Fujinma K1986，黄海水等1990)。1.2.6.2高效液相色谱法高效液相色谱法作为一种高效、高灵敏度的检测手段己被广泛用于甜叶菊糖各组份的分离、测定研究。色谱固定相的成份与淋洗液极性的搭配是分离效果的关键(黄晓兰1989，李敬慈1997)。美国人Robert等人通过改变萃取剂组份比以及使用含氧有机固定相，通过硅原子以共价键连在无机载体上做为色谱填料，用HPLC将甜叶菊提取液中八种糖甙组份实现了一次分离。MakaPuga

16、y等人选用氨基固定相Zorbax一NHZ为色谱柱，乙睛一水作流动相，用线性梯度洗脱法在十儿分钟内将八种组份分离。特别值得一提的是，MakaPugay等人还对包括中国在内的几个国家和地区的甜叶菊干叶组份含量进行了对比测定(Manrip，19%)。1.2.6.3分光光度法(蒽酮为显色剂)甜叶菊的甙元是四环二萜类化合物，在C一4位的梭基上连接着一个葡萄糖基，在C-13位上以槐糖形式连接两个葡萄糖基，构成甜叶菊糖甙。在酸性溶液中，甜叶菊糖甙易水解脱去基团上的葡萄糖基，剩下的甙元(异甜叶菊醇)不溶于水，可过滤分离。在相同的条件下水解，脱落葡萄糖的数量是相同的，它与蒽酮试剂反应生成稳定的绿色溶液。在波长6

17、20nm处有一个最大的吸收峰，浓度在0一80ppm之间，其吸光度A的大小与溶液甜叶菊糖甙浓度C呈直线相关关系，符合贝尔定律(项秀珠等，1996)。1.2.6.4分光光度法(ONS为显色剂)专利申请号:(200510010277.3).1.2.6.5液滴逆流分配层析法液滴逆流分配层析是以一种液体作固定相，另一种液体作流动相。固定相充满一组彼此相连的细管，流动相以微滴的形式穿过固定相，从而使样品在流动相与固定相之间进行分配，分离量可以从几毫克到几克。Kinghom等人用DCCC法进行了甜叶菊提取液的纯化和分离，以氯仿一甲醇一异丙醇一水(11:9:4:8)为固定相，成功地分离甜叶菊糖甙(Kingho

18、mAD，1982)。1.2.6.6甜叶菊糖甙质盘控制的微生物检测方法该部分正在申请专利，专利申请号:(200510010277.3)。1.2.6.7其他此外分离甜叶菊搪甙的方法还有超临界萃取法、毛细管电泳法和重量法(周可成，1995)。1.2.7甜叶菊糖甙的应用1.2.7.1甜菊糖甙在食品中的应用甜叶菊糖甙甜度高且热量低，作为一种新型天然的甜味剂可广泛应用于各类食品、饮料中(黄应森等1980)。广义上讲，凡用糖产品几乎都可用甜叶菊糖甙代替部分蔗糖和全部糖精。甜叶菊中含有14种微量元素、32种营养成分，因此它既是极好的糖源，又是很好的营养来源。在饮料生产中，用甜菊糖甙代替15%35%蔗糖，既符合

19、国家标准GBIO791一89要求，又不会降低产品质量，且具有如下优点:(1)可改善饮料口感，使之具有清凉爽口的甜味，可改变砂糖浓厚甜腻感。(2)实现饮料低糖化，符合饮料发展方向。(3)甜叶菊糖甙较蔗糖物理、化学性能稳定，不易成为微生物营养源，延长产品保质期。甜叶菊糖甙用于冷食品中可代替10%一25%蔗糖。除具备用于饮料中的优点外，还具有增加甜味的效果，深受喜爱甜食人的欢迎和好评。同时甜叶菊糖甙还可用于罐头、水产类、蜜饯、果脯、糕点等生产，使之实现低糖、低热量，满足人们的需求。此外甜菊搪甙还可用于调味品、酒类制品中，改变其粘稠度，增加清凉感。利用甜叶菊干叶与茶配比可制成甜叶菊茶，对糖尿病、肥胖症

20、、高血压、龋齿等有防治作用。甜叶菊糖用于口香糖、牙膏中，即可解决产品的甜味，又可降低口腔内细菌的增值率，减少龋齿发生，符合国务院减少糖精用量的通知精神(史作清等1993，丁宁2005)1.2.7.2甜叶菊干叶残渣在其他方面的应用甜叶菊叶残渣属于工业废料，却是很好的有机肥料，有机质含量极高，含Ca2十和Fe2十，可改良培肥土壤。其次，腐熟的甜叶菊叶残渣与基础基质配制成蔬菜育苗土，最适合香瓜、西瓜、柑桔、西红柿。可促进幼苗生长发育，增加幼苗干鲜物质重、促进早熟、增加甜度，是很好的育苗基质，且成本低廉。第三，甜叶菊叶残渣添加到栽培菌类培养料中，既可满足食用菌对养分的需要，又可满足食用菌对各种微量元素

21、、维生素及透气性的要求，因而发菌快、出菌早、菌质好、产量高，尤其是银耳，长得又白又大;栽培金针菇，略带甜味，风味独特。第四，甜叶菊叶残渣可以5%比例做禽类饲料，能起到预防禽类拉稀等疾病作用，调节禽类消化功能，并能提高产蛋率。第五，甜叶菊叶残渣可掺到饲料里，用来喂奶牛、奶羊，可增加奶甜度，提高奶质量和奶中微量元素、氨基酸等物质，对产奶量有一定促进作用(丁宁，2005)。1.2.8甜叶菊糖昔的市场现状和发展前景我国是一个缺糖的国家，目前食糖消费人均(年)不到7kg，距欧美国家人均40一60kg差距很大。甜叶菊糖甙以其高糖度的优势缓解了我国食糖紧缺的问题。用糖甙代替部分蔗糖不会降低产品质量，而且其成

22、本比蔗糖低50%以上。在东北地区甜叶菊甙养生长良好，昼夜温差大，土壤肥力较好，含糖量高，品质较好。甜叶菊宿根有一定的耐寒力，只要表根不裸露出地面可耐一12低温。甜叶菊一般亩产干叶150一200kg，亩挣收入700元以上，最高亩产在黑龙江省海林境内可达300kg，亩收入可达1200元以上。1990年我国甜叶菊糖甙出口量已达百吨，1993年甜叶菊糖甙出口量已逾300吨。现在我国甜叶菊糖厂(车间)有20多家，年生产能力2000吨。甜叶菊糖甙售价由每吨15万元上升至20万元以上，由此可见甜叶菊生产大有发展前途。1.3甜叶菊糖甙生产中存在的不足及待深入研究的问题甜叶菊糖甙不良风味的改良，甜叶菊糖甙有轻微

23、的类似薄荷醇的苦涩味，持续后苦味主要由三萜内酯引起，这种成分是抑制亚硝铵(致癌物质)合成的有效活性物质，无论应用粗品或精品，均不影响其安全可靠性。溶解甜叶菊糖水温越高，除后苦味效果越好，但甜度倍数相对降低。与柠檬酸、苹果酸、酒子酸、乳酸、有机酸、氨基酸合用时，对甜叶菊糖的后苦味有明显消杀效果，可起矫味作用，提高甜味质量。廖德仲2004年研究报道了甜叶菊糖甙结构和甜味关系，并通过改变连接在甜叶菊糖甙分子上不同基团，达到改善甜叶菊糖甙不良风味的目的。环状糊糖是最常用来掩盖不良风味的物质，对改善甜叶菊搪甙的不良风味也有效，其中8一环糊精可用来掩盖甜叶菊糖甙的苦味，y一环糊精可掩盖苦涩味，带盐环糊精可

24、改善产品的整体风味。甜叶菊糖普与多种物质混用时有较好的协同效果，可起到增加甜度或改善风味的作用。与甜叶菊糖甙可混用的物质有甜味剂:果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、异构化糖、蜂蜜、甘草、阿斯巴甜、乳酮糖、AK糖、山梨糖醇;酸味剂:乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸;盐类:氯化钾、氯化钠、乳酸钾、酒石酸钠:氨基酸类:丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸;其他物质:淀粉、淀粉糖浆、环状麦芽糊精。酶法改质甜叶菊糖甙就是利用生物技术将其现有的后苦味成份转化为口感清甜的成份，从而大大提高了原甜叶菊糖甙的品质和风味。普通甜叶菊糖甙与糖在酶的作用下，在原分子结构骨架上，有选择地连接葡萄糖基，即形成搪化甜叶菊糖甙。糖化甜叶菊糖甙由于没

25、有甜叶菊糖甙那样的苦味，口感大大改善(丁宁，2005)。2材料与方法2.1原料与试剂甜叶菊叶片甜叶菊糖甙样品(哈尔滨绿叶科技有限公司)甜叶菊糖甙St和RA标准品(日本和光株式会社)大孔吸附树脂（AB一8)为西安蓝晓科技有限公司生产其余试剂均为国产分析纯2.2仪器与设备KQ一300E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)SHZ一循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)MPLB型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈电子有限公司)UV-1600紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)BT124S万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)DK-98一1型电子恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)高

26、效液相色谱分析系统，1100型，所用检测器为示差检测器(上海天普分析仪器有限公司)DHG一9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司)R201系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)64R冷冻离心机(BeeKman Coulter，lne)冷冻干燥器(BeeKman Coulter，lne)玻璃层析柱(d5.080.0cm)SBSZl00数控计滴自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)2.3实验方法2.3.1甜叶菊糖甙的提取甜叶菊糖甙的浸提，通过比较实验采用蒸煮法，在1000mL的烧杯中加入自来水300mL(为原料的10倍)，加热至沸，慢慢加入甜叶菊干叶30g。轻轻搅拌使干叶完全浸泡在

27、沸水中，然后蒸煮60min。冷却到室温，过滤，得到150mL黑褐色提取液。滤渣再连续提取2次(每次加200mL自来水，蒸煮20min)。过滤后将3次提取液合并，总体积约300mL。2.3.2甜叶菊糖甙的纯化2.3.2.1甜叶菊糖甙的提纯在收集的滤液加入沉淀剂FeSO4和Ca(0H)2在80恒温水浴40min至折光率不变，用Ca(0H)2调节溶液PH为10并继续搅拌20min，静止4h。待静止后的浸提液冷却后抽滤得亮黄色滤液。2.3.2.2甜叶菊糖甙的精制将滤液通过装有大孔型吸附树脂(AB一8)的层析柱，甜叶菊糖甙几乎全部被树脂所吸附，不含有甜叶菊糖甙，弃掉滤液。用70%的乙醇洗脱树脂(AB一8

28、)所吸附的甜叶菊糖甙，到树脂由黄色变成白色为止，收集洗脱液吕将洗脱液通过阳离子交换树脂(00114.5)进行脱盐，收集脱盐后的滤液。将脱盐后的滤液通过阴离子交换树脂(D280)进行脱色收集脱色后的滤液(刘石林等1995)。2.3.2.3甜叶菊糖甙的浓缩经脱色后的滤液近似无色，将其浓缩为原体积的l/3，得到较粘稠的液体，即为甜叶菊糖甙浓缩液。2.3.2.4甜叶菊精甙的干燥与重结晶将浓缩后的甜叶菊搪甙溶液放入不锈钢托盘中，在冷冻干燥器中进行冷冻干燥(410一2Pa，8h)得到淡黄色的甜叶菊糖甙。采用不同的溶剂甲醇、乙醇、正丁醇将冷冻干燥后的淡黄色的甜叶菊糖甙进行溶解，并通过无水Na2SO4进行抽滤

29、，将滤液倒入托盘中放在通风橱中进行自然状态冷却结晶。2.3.2.5甜叶菊糖甙的提取与结晶的工艺流程甜叶菊干叶水提取过滤沉淀剂处理过滤离子交换树脂浓缩有机溶剂溶解过滤结晶2.3.3甜叶菊糖甙的分离2.3.3.1重结晶法称取甜叶菊糖甙提取后的结晶粉末0.1g，加入不同浓度的甲醇的水溶液，在70水浴加热溶解，4冷却48h，析出白色晶体，过滤得到黄色母液，测定晶体和母液含量和成分。分别将母液和晶体溶解后的溶液继续加入不同浓度的甲醇水溶液重结晶，提纯样品。2.3.3.2树脂法将提取结晶的粉末0.1g加水溶解，配成1%(mg/ml)浓度的溶液，经过Al2O3层析柱层析，用70%的乙醇溶液洗脱，加热收集后的

30、洗脱液去除乙醇，加水溶解，过硅胶层析柱层析后用等70%乙醇溶液洗脱，下边用数控计滴收集器收集。2.3.4甜叶菊糖甙的检测2.3.4.1薄层层析法(定性鉴别)将甜叶菊糖甙样品点样于薄层板上，通过对展开条件的选择进行展层，显色或在紫外灯下观测。2.3.4.2重量测定法将甜叶菊糖甙样品在酸性溶液中与2，4一二硝基苯肼反应，生成沉淀，计算甜叶菊糖甙的含量。2.3.4.3分光光度法(蒽酮为显色剂)、吸取经提取纯化后的样液2ml放入冷水浴中的比色管里，沿管壁缓缓加入10ml蒽酮试剂(暂不要摇匀，每批样品都要同时做空白参比样)。、待所有试液加完蒽酮试剂后，再逐一摇匀。然后将比色管放入沸水浴中加热12分钟。、

31、取出迅速用流动冷水冷却至约25。、以空白试样为参比将溶液在波长620nm处进行比色测定。2.3.4.4分光光度法(ONS试剂为显色剂)、将0.1g甜叶菊叶片或粗甙溶于20而水中。、称6个空试管重，一个为空白，空白中不加样品，5个平行样。、向5个管内注400微升溶液，再加500微升DNS显色液。、70水浴15min(糖具有还原性，DNS显色液为亮黄棕色具有氧化性，两者在水浴中反应，DNS变为深黄棕色)、拿出后，冷却。、再称重。加水，使每个管重4g。、测吸光值。2.3.4.5化学发光法NaOH碱性介质中，K3Fe (CN)6和KMnO4氧化甜叶菊糖甙产生强的化学发光，以浓度和峰面积分别为横和纵坐标

32、，绘制标准曲线。线性范围为5.0、10-5一1.010-2g/ml，其回归方程为y(峰面积)360.8x(mg/mL-1)+286.3，r0.9941，根据标准曲线方程计算甜叶菊糖2.3.5.甜叶菊糖甙的微生物研究2.3.5.1甜叶菊糖甙的质量控制微生物检测方法(l)培养基的制备均是牛肉膏蛋白陈培养基(液体)牛肉膏0.5g蛋白陈1.0g氯化钠0.59蒸馏水100ml培养条件:3724h(2)母液制备:将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别按最佳培养基条件制备成菌母液。、在分析对象样品中提取甜叶菊糖甙，并制备成母液。、将甜叶菊糖甙溶液按倍数稀释于试管中，分别取同样体积的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液于

33、这一系列试管中，以水和充足条件培养分别为对照l和对照2，37培养24小时。、甜叶菊糖甙抑制金黄色葡萄球菌的观察。、甜叶菊糖甙不抑制大肠杆菌的观察。培养24小时，观察试管的混浊程度(用分光比色法)。、根据标准甜叶菊糖甙对金色葡萄球菌观察的标准抑制程度(根据混浊度)，可确定出分析对象样品中甜叶菊糖甙的浓度。、如果某些物质对的试验有抑制作用，表明在的试验检测中将有偏差，需要进一步校正结果。2.3.5.2 DNS比色法测假丝酵母对甜叶菊糖甙的分解、取巧片直径glnm鲜叶加入到试管中，加入3m180热水，超声30分钟。、取溶液1ml加入0.5m1DNS，100水浴20分钟。、接菌后分别在24h、48h、

34、72h、96h，分别以蒸馏水和未加DNS的甜叶菊糖甙溶液为对照，测其吸光值。、接菌后48h，分别在40、70、100测其吸光值。3结果与分析3.1提取方法对甜叶菊糖甙的影响3.1.1浸提试验条件选择3.1.1.1不同浸提方法的比较甜叶菊糖甙浸液除了用蒸煮法获得以外，还可以通过冷水浸泡法或发酵法得到。3种方法提取甜叶菊糖甙的产率见下表。从表1中可以看出，甜叶菊糖甙的提取率以蒸煮法为最高，冷水浸泡法次之，发酵法较低。发酵法较低是由于在酶和微生物作用下部分甜叶菊糖甙发生了分解之故。不同浸提法在浸提时间、产品品质和工艺操作方面的比较见表3一2。从表3一2可以看出，3种处理方法中，蒸煮法的生产周期短，工

35、艺操作简单，产品质量较优。因此蒸煮法适宜于工业生产。3.1.1.2蒸煮法提取甜菊糖甙的最佳水量。采用蒸煮法，浸提时间为10、20、30、40、50、60、70min，料液比l:15。表3一3的结果表明，在一定的时间范围内，甜叶菊糖甙的得率随着时间的增加而增大，在10一6Omin，甜叶菊糖甙的提取量的差异比较显著，60min后差异不明显，甜叶菊糖甙得率变化不大，从色泽和味觉观察，这时的滤渣味很淡，说明叶片中的甜叶菊糖甙已基本提取完全，故浸提时间选择60min为宜，不同浸提时间试验结果。3.1.1.3蒸煮法提取甜叶菊糖甙的和最佳时间采用蒸煮法，浸提时间60min，料液比1:4、1:8、1:10、1

36、:15、1:20。试验数据如表3一。多次试验表明，在用蒸煮法提取甜叶菊糖甙时，加水量为千叶重的10倍效果最佳，可将甜叶菊叶片中98%以上的甜叶菊搪甙提取出来，缩短了提取时间，如果水太少，甜菊糖甙提出速度将会因溶液浓度过高而减慢;如果水太多，提取率略有提高，但体积增大，浓度降低，不但后续步骤中所需沉淀剂的用量增加，而且浓缩时间长，增大成本，影响树脂对甜叶菊糖甙的吸附。3.1.1.4蒸煮法中加叶的先后顺序对甜叶菊糖甙提取率的影响从上表中可以看出，沸水加叶的提取率比冷水加叶的高。这是因为细胞中的水解酶和微生物对甜叶菊糖甙有分解作用。沸水加叶可以杀菌、杀酶，避免了甜叶菊糖甙分解，从而提高了甜叶菊糖甙的

37、提取率。3.1.2不同沉淀剂对除杂提纯的作用甜叶菊搪甙的水提取液呈茶褐色，其中除目的成分甜叶菊糖甙外，浸液中所含的有机杂质主要有蛋白质、有机酸、色素、辑质和其它糖等。为了减少下步精制糖液的树脂的负荷和延长树脂的使用寿命，需要用沉淀剂对提取液进行预处理，以除去大部分不纯物，能防止树脂的劣化和减少树脂的消耗。文献中报道使用了一些对人体有害的铝盐和高分子沉淀剂，由于微量的沉淀剂将残存于最终产品中，因此本实验选用了价格便宜、无毒、无臭、除杂效果较好的Ca(0H)2和FeSO4作为沉淀剂(质量比为2:l)。其中Ca(0H)2不但能中和有机酸，防止酸水解甜叶菊糖甙，而且使有机酸生成钙盐沉淀，并能吸附一定量

38、的杂质。另外，Ca(0H)2电离出的Ca2也能与蛋白质等形成沉淀。FeSO4在水中可形成Fe(OH)2胶体，该胶体具有吸附作用，尤其对离子型杂质的吸附作用较强，吸附后形成沉淀，故除杂效果也很明显。乙醇能溶解甜叶菊糖昔而不溶解杂质，利用这一性质可使甜叶菊糖甙与杂质分离。3.1.3离子交换树脂的除杂作用离子交换树脂在工业上常用于精制离子型化合物，其主要作用在于除去Ca2+、Fe2十、Fe3十、Mg2十、NO3一、SO-2、Cl一、Na十、CO3-2等无机离子。离子交换树脂除去无机离子非常完全，但对非离子型的有机物除去效果则不理想。因此，在除去无机离子之前，应先除去有机杂质。目前，用离子交换树脂处理

39、浸液是得到高纯度甜叶菊糖甙的关键和有效措施。交换后的溶液为乙醇及含有少量非离子杂质的甜叶菊糖甙溶液，在乙醇溶液浓缩后，再用稀甲醇溶液重结晶，即可得到纯度较高的甜叶菊糖甙。3.2甜叶菊糖甙的分离3.2.1重结晶法3.2.1.1甜叶菊糖甙在甲醇中的重结晶甜叶菊糖中含量最高的组份甜叶菊糖甙在甲醇与其它糖甙相比较溶解度低，通过特殊条件控制的甲醇重结晶方法可析出大量高纯度的甜叶菊糖甙，从而使母液中莱鲍迪甙A(RA)的相对含量超过其它组分。因此，如何控制重结晶的条件，尽可能多的除去甜叶菊糖甙，以提高母液中剩余莱鲍迪甙A的相对含量是关键。表3一6和表3一7分别列出了甜叶菊搪糖甙在不同体积的甲醇中重结晶所得晶

40、体和结晶母液中甜叶菊搪甙(St)、莱鲍迪甙A(RA)、莱鲍迪甙C(RC)的相对含量。从表3一6、表3一7可以看出，结晶晶体重量随甲醇体积的增加而减少，晶体中甜叶菊糖甙的纯度随甲醇体积的增加而升高。这是因为当体系浓度低时，甜叶菊糖甙初期的结晶速度缓慢，结晶过程中包埋下来的莱鲍迪甙A和莱鲍迪甙C的量较少。表3一6中No.2结晶所得的甜叶菊糖甙的纯度虽没有在更稀甲醇溶液中所得甜叶菊糖甙的高，但相对结晶重量较多，母液中剩余的甜叶菊糖甙较少，莱鲍迪甙A和甜叶菊糖甙的比例(RA/St)相对较高。No.1虽然结晶重量最大，但这种情况下，莱鲍迪甙A和莱鲍迪甙C也都处在过饱和状态，均有不同程度的结晶，使母液中莱

41、鲍迪甙A的相对含量反而有所下降。因此，比较而言，No.2的重结晶条件即可以除去尽可能多的甜叶菊糖甙，又对莱鲍迪甙A的损失较少，可得到莱鲍迪甙A相对含量最高的初级母液。图3一7是甜叶菊糖甙、甲醇重结晶晶体及其母液的HPLC谱图。由于水的极性很强，因此在甲醇中加入少量的水对甜叶菊糖的结晶性能影响很大，如表3一8和表3一9所示。由表可见，在甲醇重结晶溶液中加入水，可使甜叶菊糖甙结晶晶体的重量明显减小，水含量越多，结晶量越少，但晶体中甜叶菊糖甙的纯度却显著提高，母液中RA/St的比值比未加水时偏低。这说明在一次重结晶溶液中加入水不利于得到高莱鲍迪甙A的母液。3.2.1.2母液的浓缩结晶如前分析，甜叶菊

42、糖甙溶液在甲醇中重结晶，当甲醇浓度适中时(如表3一7No.2)，可得到莱鲍迪甙A相对含量最高的结晶母液(RA/St2.460)。如果将此母液浓缩至使莱鲍迪甙A过饱和，而莱鲍迪甙C和甜叶菊糖甙还没有达到过饱和状态时，将可能析出莱鲍迪甙A含量高的晶体。表3一10列出了一定体积的结晶母液浓缩至不同体积时再次结晶所得晶体的相对含量。由表可见，母液浓缩至10m1时，析出晶体的重量以及莱鲍迪甙A的含量都较母液浓缩至5ml时高，因为母液浓缩至5ml，体系粘度过大，晶种不易形成，结晶困难。母液浓缩至15ml时，RA/St的含量为最高，但所得结晶重量太少，从实际角度出发不够经济。因此，母液重结晶以浓缩至原体积的

43、20%左右为最佳。有文献报道，莱鲍迪甙A在异丙醇中的溶解度较其它甜叶菊糖甙类小，考虑到这一点，在浓缩母液中加人一定量的异丙醇将有利于莱鲍迪甙A晶体的析出，表3一11反映出在浓缩母液中加入异丙醇对结晶的影响。异丙醇含量升高，晶体中RA/St比值明显升高，而且莱鲍迪甙C的含量也有所下降。可见，加入异丙醇有利于提高结晶中莱鲍迪甙A的含量。3.2.1.3菜鲍迪甙A的纯化将母液重结晶所得的高莱鲍迪甙A晶体再在甲醇一水体系中反复重结晶，可得到高纯度的莱鲍迪甙A，图3一8反映出不同莱鲍迪甙A纯度与结晶熔点之间的关系。图3一9给出纯度大于98%的莱鲍迪甙A的HPLC谱图。3.2.2柱层析法经过沉淀剂沉淀、大孔

44、树脂和离子交换树脂吸附的甜叶菊糖甙样品中还含有微量的蛋白等非离子杂质，经过Al2O3层析柱层析吸附，用70%的乙醇洗脱后加热挥发除去剩余的乙醇后，加入装有硅胶的层析柱，利用甜叶菊糖甙各组分在硅胶中的展开速度不同将其分开，再用70%的乙醇洗脱硅胶树脂柱，用数控计滴收集器收集洗脱样液。3.3甜叶菊糖甙的测定方法3.3.1薄板层析法(定性鉴别)不同硅胶薄板的分离效果硅胶用量实验采用的普通玻璃板，尺寸为2040.3cm，根据涂板和点样效果选择了配比为每块板硅胶1g、调浆剂5ml。硅胶的选择实验采用青岛产硅胶和进口MERCK公司硅胶用同一种调浆剂蒸馏水调浆制板，于同一展开体系中展开，甜叶菊糖甙、麦芽糖和

45、葡萄糖的Rf值见表3一13。进口硅胶对甜叶菊糖甙、葡萄糖、麦芽糖的分离效果最明显，而且进口硅胶颗粒细(MERCK公司硅胶孔径为15m;青岛产硅胶孔径为38m)，涂板均匀，展层时间短，分离效果好，故以后实验所用硅胶都是进口硅胶作为吸附剂(表3一13)。湿法制板调浆剂的选择各种盐的溶液代替水制备薄板能增加糖在固定相中的溶解度，提高薄板的负荷量，而且使糖的斑点集中，改善分离效果。表3一14是几种不同溶液作为调浆剂制成的薄板在同一展开体系中对糖的分离效果的影响。从表3一14中可以看出，制板时不加粘合剂CMC，改用0.6mol/L的硼酸溶液调浆制板，对这几种糖的分离效果较好。不同展开体系对糖的分离效果的

46、影响展开剂的选择是薄层色谱分离成功的关键，对于甜叶菊糖甙、葡萄糖、麦芽糖等难于分离的物质，我们选用了多元化的展开剂，通过筛选选择了五种展开体系，各糖的Rf值见表3一15。表3一14展开体系对糖分离效果(Rf)的影响在层析缸中放入40ml层析液，配比如下:展开体系1:正丁醇:乙醇=4:1展开体系2:正丁醇:乙酸:乙醚:水=9:6:3:l展开体系3:氯仿:甲醇:水=30:20:4展开体系4:氯仿:甲醇=6:4展开体系5:丙酮:乙醇1:1是St是RA展开体系正丁醇:乙酸:乙醚:水(9:6:3:l)能十分清晰将三种糖分开，同时也能将甜叶菊糖甙中的St和RA两种组分分开(图3一13)。不同浓度硫酸的显色

47、效果把甜叶菊糖甙、葡萄糖、麦芽糖标准样品配成1%0溶液在同一种展开体系中展开晾干后分别用不同浓度的硫酸溶液雾喷，喷均匀晾干后放在110烘箱内，比较显色效果和显色时间(表3一15)。结论根据以上实验结果，建立了一种定性分析鉴定甜叶菊糖甙和葡萄糖、麦芽糖几种成分的薄层层析方法:MERCK公司硅胶;展开体系:(正丁一醇:乙酸:乙醚:水=9:6:3:1);显色剂:50%的硫酸。用本方法能够灵敏区分出两种甜叶菊糖甙St和RA以及麦芽糖和葡萄糖。 3.3.2液相色谱法高效液相色谱仪的系统流程图如图3一4所示:色谱条件:固定相:0.5mNH2色谱柱流动相:乙腈一水(75:25v)流速:1.2ml/min柱温

48、:25进样量:20l紫外检测波长:210nm色谱条件的选择:(1)色谱柱的选择:化学键合烷基柱在C一18柱上用水作流动相对不衍生单、双、三糖进行分组分离，糖的保留时间较短且分离效果不好。由于所有单糖结构相近很难分离，所以C一18柱不适合于较复杂糖混合物的分析。烷基柱长时间使用，使峰拖尾并且保留时间缩短，因此不易采用测定甜叶菊糖甙。氨基键合柱氨基键合柱通常在室温下用乙腈一水作流动相，分离常见的单糖和低聚糖，糖出峰顺序为单糖、双糖和较高低聚糖。硅胶柱硅胶柱可用的流动相范围很宽，从非极性烃类化合物到极性很强的系统。糖的大多数分离所需时间较短，未衍生的糖以乙腈一水为流动相被迅速洗脱而不能分离，应用受到

49、限制。通过对色谱柱的比较，选择氨基键合柱。(2)乙腈浓度选择分别以65%、70%、75%、80%、85%、85%、90%乙腈浓度实验，实验结果如下表通过对实验分离结果比较表明，采用不同比例的乙腈:水作溶剂溶解甜菊糖甙，分离效果明显不同。75%和80%乙腈分离效果好，所以，根据甜叶菊糖甙的分离效果和乙腈价格考虑，本文选择最佳乙腈含量为75%。(3)检测器的选择:RID检测器是HPLC测糖最常用的检测器，它具有稳定、易于操作，样品不被破坏和具有较好的灵敏度等优点，应用最广泛。因此检测器选用为示差检测器。结果计算:浓度峰面积标准曲线测甜叶菊糖甙标准溶液峰面积，以浓度为横坐标峰面积为纵坐标作浓度一峰面

50、积标准曲线图。采用NH2色谱柱，以乙腈一水(75:25v/v)为流动相对甜叶菊糖甙定量分析，甜叶菊糖甙浓度在0.lmg/ml10mg/ml的范围内，浓度和峰面积成良好的线性关系，绘制标准甜叶菊糖甙样品峰面积一浓度标准曲线分别为:y=95.623x一0.4041(R2=0.9965)。3.3.3重量测定法反应过程如下:3.3.4分光光度法(蒽酮为显色剂)标准曲线的绘制:准确称取经80干燥至恒重的甜叶菊糖甙纯品0.100g于250ml平底烧瓶中，先加入20mlH2O使之溶解，然后加入H2Oml ，l0%H2SO4混匀，在沸水浴中水解1.5小时，冷却后过滤，将滤液直接滤入100ml的容量瓶中，用少量

51、水洗涤瓶壁和滤纸3一4次，最后加水至刻度摇匀，即为100ppm甜叶菊糖甙标准液。然后再准确吸取l、2、3、4、5、6、7、8ml分别置100ml容量瓶中，用水稀释定容即得10、20、30、40、50、60、70、80ppm的甜叶菊糖甙标准溶液。按本实验样品测定的方法显色和比色，以吸光度A为纵坐标，甜叶菊糖甙标准溶液浓度C为横坐标，绘制标准曲线(图3一7)。结果计算:甜叶菊糖甙(%)待测液甜叶菊糖甙浓度10-6稀释倍数/干样重(g)1003.3.5分光光度法(ONS试剂为显色剂)3.3.5.1实验数据3.3.5.2实验条件的选择甜叶菊糖普溶液和DNS试剂反应时间的影响称取样品粉末2g加入1000

52、间蒸馏水，配成Zmg/ml甜叶菊溶液，和DNS试剂等体积混合，在100不同的加热时间里反应后测定其吸光值。由上图可知，在加热反应2而n后吸光值变化不大，因此本实验选用加热反应时间为15min。反应温度的选择称取待测样Ilnl和lmlDNS试剂分别在30、40、50、60、70、80、90反应后测定其吸光值如下OD30OD40OD50OD60OD70OD80OD90通过比较发现甜叶菊糖甙标准液在70一80之间时吸光值已稳定，葡萄糖和麦芽糖等物质和DNS试剂反应显色完全，因此选择70为葡萄糖和麦芽糖等反应温度。样品含量实验取甜叶菊糖甙待测样1ml和lmlDNS试剂在70反应后，测定其吸光值OD70

53、=1.071。取甜叶菊糖甙待测样lml和lmlDNS试剂在100反应后，测定其吸光值OD1001.191。取甜叶菊糖营待测样1而和2而DNS试剂在70反应后，测定其吸光值OD70=1.082。取甜叶菊糖甙待测样lml和2mlDNS试剂在100反应后，测定其吸光值OD100=l.193。通过对实验结果对比发现，反应按体积比l:1和体积比1:2混合，吸光值没有多大改变，因此本实验选择甜叶菊糖甙待测液和DNS试剂1:1混合反应。3.3.5.3实验结果标准曲线方程计算:70Y16.17x一0.0064 R20.995870Y一2.061x一0.0389 R20，9959100y=6.614x R20.

54、9975100y=11.97x R20.9912100甜叶菊糖甙y=0.5333x一0.1365 R20.9943甜叶菊糖甙浓度计算:含甙量(%) OD100一(OD70+0.0064)16.614/16.17+0.1365+ OD100一(OD70+0.0389)11.97/12.061+0.13654/0.53333.3.6化学发光法主蠕动泵分别将载流H2O和K3Fe(CN)6溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入分析系统。待基线平稳后，副蠕动泵将甜叶菊糖甙溶液以35r/min的流速通过十六通注射阀(注样时间:10s)注入于载流中，与K3Fe(CN)6溶液混合，在流通池

55、中产生化学发光(如图3一18)，根据化学发光强弱采用外标法定量。3.3.6.1化学发光动力学曲线K3Fe(CN)6氧化甜叶菊糖甙产生化学发光如图3一10)，从进样到化学发光达到最大值时间约为4s，6s发光强度衰减至本底附近。3.3.6.2测定甜叶菊糖甙条件的选择1.氧化剂的选择在酸性介质(1mol月H2SO4)中KMnO4和碱性介质(0.5mol/lNaoOH)中K3Fe(CN)6、H2O2分别做氧化剂进行直接氧化甜叶菊糖甙的化学发光研究结果表明，KMnO4在酸性介质中和K3Fe(CN)6在碱性介质中做氧化剂时，产生化学发光。试验结果表明，酸性KMnO4的氧化性强于碱性K3Fe(CN)6，酸性

56、KMnO4不仅可以甜叶菊糖甙，还可以氧化多轻基醇、糖、维生素C等物质，K3Fe(CN)6 Fe(CN) 3一6在该体系中表现出最好的发光特性，本文选择碱性的K3Fe(CN)6作为氧化剂来测定甜叶菊糖甙。2. K3Fe(CN)6与NaOH浓度影响K3Fe(CN)6的浓度对该体系的化学发光强度有很大的影响。本文在固定了甜叶菊糖甙和碱性介质的浓度下，详细考察了不同浓度的K3Fe(CN)6。(0一1.010-3mol)和NaOH(1.0一1.010-5mol/l)对该化学发光反应的影响。结果表明，当K3Fe(CN)6。的浓度为5.010-4mol/l时，发光强度最大。K3Fe(CN)6只有在碱性介质中

57、，才能氧化甜叶菊糖甙产生化学发光。试验表明NaOH的最佳浓度为0.5mol/l。3.流速的影响在该化学发光流动体系中，流速太慢导致最大发光在流通池之前;流速太快导致发光在流通池之后。主蠕动泵和副蠕动泵的每分钟转数为0一99，对它们的转数进行了组合设定发现，最佳转数分别为45r/min和35r/min。从进样到化学发光达到最大值需要2s，调整阀池距为2cm时使最大发光恰好能被光电倍增管完全检测。4.线性范围、检测限及灵敏度在上述选定的最佳实验条件下，测定了峰面积与甜叶菊糖甙浓度的关系，结果表明，甜叶菊糖甙在0.05一10mg/mL-1的浓度范围内与化学发光强度呈线性关系，其回归方程:y(峰面积)

58、36o.sx(mg/mL-1)+256.3，r0.9941，检出限为0.05 mg/mL-1对5 mg/mL-1，甜叶菊糖甙溶液连续测定，每次得4个峰值，重复7次，相对标准差为1.7%。5.表面活性剂的影响表面活性剂的影响表面活性剂对许多化学发光体系有影响，能显著地改变化学发光强度。研究了1种非离子型表面活性剂(TWeen80)，1种阳离子型表面活性剂(碘化四甲胺)，1种阴离子表面活性剂(十二烷基磺酸钠SDS)，对该化学发光体系的影响。结果表明，这些表面活性剂对该化学发光体系均不产生显著的影响。6.干扰实验甜叶菊糖甙来源于叶片，在提取过程中共存其他组分，它们可能对该化学发光体系测定甜叶菊糖甙有

59、一定的影响，为此研究了1000倍的Na+Cl-、K+Br-、CO3-2、SO4-2;和NO3-、100倍的淀粉、糊精以及无水乙醇等分别对l mg/mL-1，的甜叶菊糖甙进行干扰测定实验结果表明:它们不干扰测定，因此，可以用无水乙醇或水溶解甜叶菊糖甙比较相同浓度(mg/mL-1)蔗糖、葡萄糖和甜叶菊糖甙发光强度的研究表明，峰高和峰面积分别为:22和532、78和4065，可见葡萄糖对甜叶菊糖甙有一定的干扰，葡萄糖的醛基被氧化成梭基时有化学发光，而葡萄糖和果糖结合成蔗糖之后，葡萄糖的醛基己经不存在，它们不干扰测定。因此，采用流动注射化学发光法测定甜叶菊糖甙含量时，不需对样品进行纯化处理，即可准确定

60、量。7.发光机理推测铁氰化钾作为氧化剂直接氧化产生化学发光，已用于直接化学发光法测定了维生素Bl和四环素，芦丁。在这些化学发光反应中，发光体为药物的氧化产物。本文用LS45荧光光度计扫描了铁氰化钾、甜叶菊糖甙标准液及铁氰化钾+甜叶菊糖甙混合液的发射光谱图，结果表明，甜叶菊糖甙有微弱的荧光。8.标准溶液甜叶菊糖甙的扫描甜叶菊糖甙在全波长(190一1100nm)扫描的研究结果表明，223nm、231nm的紫外有最大吸收峰哈尔滨市绿叶科技有限公司生产的甜叶菊糖甙和本实验室栽培的甜叶菊叶片提取物都有相同的紫外最大吸收峰。坂牧成惠等人2004年用HPLC检测St和RA的方法是在210nm波长。3.3.6