酶工程原理与技术-笔记-精要

1、绪论酶的生产与应用的技术过程称为酶工程第一节 酶的根本概念同时酶的催化作用具有：专一性、高效性，作用条件温存等特点其次节 酶的分类与命名按其化学组成不同，酶可以分为主要由蛋白质组成蛋白类酶P 酶和主要由核糖核酸组成的核酸类酶R两大类别。蛋白类酶和核酸类酶的分类命名的总原则是一样的依据酶的作用底物和催化反响的类型所区分一、蛋白类酶的分类与命名推举名：在惯用名称的根底上，加以选择和修改而成。酶的推举名一般由两局部组成：第一局部为底物名称，其次局部为催化反响的类型。后面加一个“酶” 字 -as。不管酶催化的反响是正反响还是逆反响，都用同一个名称。系统名称Systematic nam：包括了酶的作用底

2、物，酶作用的基团及催化反响的类型。一蛋白类酶P的分类原则依据酶催化作用的类型，将蛋白类酶分为 6 大类。第 12345 大类，异构酶 第 6 大类，合成酶或称连接酶每个大类中，依据酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为假设干亚类。每一亚类中再分为假设干小类。每一小类中包含假设干个具体的酶六大类蛋白类酶简介1、氧化复原酶 Oxidoreductases催化氧化复原反响，其催化反响通式为：AH2+ B A +BH22、转移酶Transferases反响通式为：AB + C A + BC3、水解酶 (Hydrolases)催化各种化合物进展水解反响的酶称为水解酶。其反响通式为： AB HO AOH

3、BH24裂合酶 (Lyases)催化一个化合物裂解成为两个较小的化合物及其逆反响的酶成为裂合酶。其反响通式为：AB A B乙酰乳酸合酶 2-乙酰乳酸 CO2 2-丙酮酸5、异构酶 (Isomerases)催化分子内部基团位置或构象的转换的酶称为异构酶AB。 6isomeras消旋酶racemas、变位酶mutas、表异构酶epimeras、顺反异构酶等。6、连接酶(Ligases) 或合成酶(Synthetases)连接酶是伴随着ATP 等核苷三磷酸的水解，催化两个分子进展连接反响的酶。其反响通式为：A + B + ATP AB + ADP + Pi 或 AB +AMP +PPiR依据酶作用的

4、底物是其本身RNAin cisR子间催化in transR在每个大类中，依据酶的催化类型不同，将R 酶分为假设干亚类。如剪切酶，剪接酶，多功能酶等可将分子内催化的RSelf-cleavage自我剪接酶Self-splicing等亚类分子间催化的R 酶可以分为RNA 剪切酶，DNA 剪切酶，多肽剪切酶，多糖剪接酶等亚类。在每个亚类中，依据酶的构造特点和催化特性的不同，分为假设干小类。第三节 酶活力的测定酶活力enzyme activity的大小可以用肯定条件下酶所催化的反响初速度表示。在外界条件一样的状况下，反响初速度越大，酶的活力越高。一、酶活力测定方法酶活力测定的方法：化学测定法、光学测定法

5、、气体测定法等。酶活力测定的要求：快速、简便、准确。酶活力测定的步骤：依据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成肯定浓度的底物溶液。依据酶的动力学性质，确定酶催化反响的温度、pH 值、底物浓度、激活剂浓度等反响条件。(3)在肯定的条件下，将肯定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时登记反响开头的时间。(4) 反响到肯定的时间，取出适量的反响液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的削减量。留意：假设不能即时测出结果的，则要准时终止反响，然后再测定。终止酶反响的方法：1加热使酶失活参加适宜的酶变性剂如三氯醋酸调整pH二、酶活力单位1 min1 mol1 个酶活力单位。这个单位称为国际单位IU

6、国际上另一个常用的酶活力单位是卡特Kat。在特定条件下，每秒催化1 mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特Kat 1Kat = 610 7IU酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条件下，单位重量mg蛋白质或RNA 所具有的酶活力单位数。酶比活力酶活力单位/ mg 蛋白或RNA三、酶的转换数与催化周期酶的转换数Kp，又称为摩尔催化活性molar catalytic activity底物转化的分子数。即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。Kpmin-1转换数的倒数称为酶的催化周期。催化周期是指酶进展一次催化所需的时间。单位为毫秒msec或微秒sec。四、固定化酶的活力测定(4) 固定化

7、酶的比活力测定：在固定化酶中，一般承受每克g干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。即：比活力= 酶活力单位/ cm2酶结合效率与酶活力回收率的测定酶结合效率又称为酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率。酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。相对酶活力的测定具有一样酶蛋白或酶RNA量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。酶在应用过程中也表现出一些不尽人意之处:活力不高稳定性差分别纯化困难第一篇酶的生产1、提取分别法 2、生物合成法 3、化学合成法第一节 细胞的选择酶生产的细胞必需具备的条件：1、酶的产量高2、简洁培育和治理3、产酶稳定性好4、利于酶的分别纯化5、

8、安全无毒一、 微 生 物根本要求： 12 发酵周期短,产酶量高 3 不易变异退化 4于分别 567见微生物制取的酶,需做广泛的毒性试验,包括慢性中毒试验。其次节 培育基的配制一、培育基的根本成分1、碳源大多数产酶微生物承受淀粉或其水解产物，如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。植物细胞以蔗糖为碳源；动物细胞以谷氨酰胺或谷氨酸为碳源2、氮源：有机氮源和无机氮源两大类。不同的细胞对氮源有不同的要求：动物细胞要求有机氮源；植物细胞主要使用无机氮源；微生物细胞中，异养型细胞要求有机氮源 自养型细胞承受无机氮源在使用无机氮源时要留意铵盐和硝酸盐的比例C/的总量与氮元素N总量之比。培育基的设计原则1

9、、选择适宜的养分物质2、养分物的浓度及配比适宜3物理化学条件适宜4、经济节约 5、细心设计、试验比较三、植物细胞培育基1、植物细胞培育基的特点植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐植物细胞需要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。植物细胞要求的氮源一般为无机氮源植物细胞一般以蔗糖为碳源2、常用的植物细胞培育基MSB5WhiteKM-8P一动物细胞培育基的组分1氨基酸必需氨基酸谷氨酰胺谷氨酸 2维生素无血清需补充VBVC 3无机盐调整渗透压4葡萄糖：5 激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松6 生长因子：无血清需添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因

10、子二动物细胞培育基的配制P45培育基中溶解氧的量打算于肯定条件下氧气的溶解速度氧的溶解速度又称为溶氧速率或溶氧系数，以 Kd 表示。溶氧速率是指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量。其单位通常以 mmol/hL表示。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培育液的性质等有亲热关系。耗氧速率、细胞浓度的概念P48第四节 微生物发酵产酶一、微生物发酵产酶的方式及其特点固体培育发酵液体深层发酵固定化细胞发酵 固定化原生质体发酵二、提高酶产量的措施1添加诱导诱导物的分类酶作用底物型诱导物酶的反响产物酶作用底物类似物作诱导物 酶最有效的诱导物往往不是酶的作用底物，也不是酶的反响产

11、物而是可以与酶结合又不能被酶催化的 底物类似物。2、把握阻遏物浓度3、添加外表活性剂 外表活性剂分为离子型和非离子型两大类适量的非离子型外表活性剂，如吐温Twee、特里顿(Triton产量增加。离子型外表活性剂对细胞有毒害作用4、添加产酶促进剂三、 酶发酵动力学一酶生物合成的模式；同步合成型 连续合成型中期合成型 滞后合成型中期合成型酶的共同特点是：酶的生物合成受到产物的反响阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而且酶所对应的mRNA 培育基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶mRNA 稳定性很好，可以在细胞生进步入平衡期后的相当长的一段时间内，连续进展

12、酶的生物合成。在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最抱负的合成模式应是连续合成型。对于滞后合成型的酶，要设法降低培育基中阻遏物的浓度，尽量削减甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开头；对于中期合成型的酶，则要在提高 mRNA 的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开头时二细胞生长动力学1950 年，法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程？莫诺德方程中的mKS宏观产酶动力学的争辩说明：产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。产酶动力学模型或称为产酶动力学方程可以表达为？一固定化细胞发酵产酶的特点(1)提高产酶率

13、(2)可以反复使用或连续使用较长时间(3)发酵稳定性好，对温度、pH 的适应范围扩大，基因工程菌的质粒稳定，不易丧失：(4)缩短发酵周期， 提高设备利用率(5)产品易于分别纯化(6)只适用于胞外酶等胞外产物的生产固定化原生质体的特点(1)变胞内产物为胞外产物：(2)提高酶产率：(3)稳定性较好：(4)易于分别纯化固定化原生质体发酵产酶在工艺条件把握方面需要留意以下问题：(1) 渗透压的把握：(2)防止细胞壁再生：(3)保证原生质体的浓度第五节 植物细胞培育产酶一、植物细胞的特性与微生物相比：细胞大；生长速率、代谢速率低，倍增时间、生产周期长；养分要求简洁；大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生

14、产要求肯定的光照强度和光照时间；对剪切力敏感；主要目的产物为色素、药物、香精和酶第六节 动物细胞培育产酶动物细胞主要用于生产疫苗、激素、多肽生长因子、酶：胶原酶、尿激酶等 单克隆抗体、非抗体免疫调整剂一、动物细胞的特性没有细胞壁；适应环境的力量差，脆弱 细胞大；以集群形式存在，细胞培育中大局部细胞具有群体效应、锚地依靠性、接触抑制性、功能全能性；养分要求简单第四章 酶的分别纯化：12、物理裂开法12、压力差裂开法：高压冲击法 突然降压法 渗透压变化法超声波裂开法3、化学裂开法4、酶促裂开法 自溶法溶菌酶、葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等。也称为酶的抽提。酶提取时首先应依据酶的

15、构造和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中， 非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进展提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。二、影响酶提取的主要因素主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中集中的速度。此外，还受到温度、pH第三节 沉淀分别沉淀分别是通过转变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分别的技术过程沉淀分别的方法主要有：盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉

16、淀法等一、盐析沉淀法加肯定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分别的过程一般在低盐浓度的状况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的上升而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度上升到肯定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的上升而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析盐之所以会转变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用，使蛋白质分子外表的电荷转变，同时由于离子的存在转变了溶液中水的活度，使分子外表的水化膜转变饱和度是指溶液中参加的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值饱和硫酸铵的配制方法：过量硫酸铵5060保温 趁热过滤02512溶液二、离心方法的选择对于超

17、速离心，可以依据需要承受差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。1、差速离心：差速离心是指承受不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分别的方法。2、密度梯度离心样品在密度梯度介质中进展离心，使沉降系数比较接近的物质分别的一种区带分别方法。3、等密梯度离心当欲分别的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上飘浮，只要时间足够长，就可以始终移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置等密度点，形成区带。这种方法称为等密梯度离心，或称为平衡等密度离心。等密梯度离心常用的离心介质是铯盐，离心条件：离心机、离心方法、离心介质、密度梯度

18、、离心力或离心速度和离心时间第五节 过滤与膜分别过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同外形的物质分别的技术过程。依据过滤介质的不同, 过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。依据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等4 大类第六节 层析分别 安排系数等的不同，使各组分以不同比例分布在两相固定相、流淌相中。当流淌相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分别纯化。分别纯化酶常承受：吸附层析、安排层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等一、吸附层析1、吸附层析原理：任何两个相之间都可以形成一个界面，其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附。但凡能够将

19、其它物质聚拢到自己外表上的物质称为吸附剂。吸附剂一般是固体或者液体，在吸附层析中 用力主要是范德华力。其特点是可逆的。吸附层析通常承受柱型装置，先装柱、加液，而后洗脱在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。适当时间后，不同物质在吸附柱内形成各自的区带2、洗脱方法三种方法：溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法、吸附剂与洗脱剂的选择吸附剂的选择：吸附层析的关键因素极性物质简洁被极性外表吸附；非极性物质简洁被非极性外表吸附；溶解度越大的物质越难被吸附。吸 大洗脱剂的选择：要依据吸附剂的性质和被吸附物的特点来选择适宜的洗脱剂。对于极性组分，用极性大的溶剂洗脱效果较好。而对于非极性组分

20、，则用非极性溶剂洗脱较佳。洗脱剂的种类有：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。洗脱剂的选择要留意以下各点：洗脱剂不会与吸附剂起化学反响，也不会使吸附剂溶解。洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流淌性好，简洁与被洗脱的组分分别。洗脱剂要求肯定的纯度，以免杂质对分别带来不利影响二、安排层析安排层析是利用各组分在两相中的安排系数不同，而使各组分分别的方法。安排系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解到达平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，安排系数是一常数，以K三、离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团活性基团对各种离子的亲和力不同而到达分别目的的一种

21、层析分别方法。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进展酶的分别纯化。在溶液的 pH 值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂引入碱性基团进展层析分别；四、凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流淌相中所含各种组分的相对分子质量不同而到达物质分别的一种层析技术1 、凝胶层析的根本原理凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组

22、分依据相对分子质量由大到小的挨次先后流出层析柱，而到达分别的目的凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程五、亲和层析原理六、层析聚焦原理电场强度是指每厘米距离的电压降。溶液的pH3溶液的离子强度: 4电渗:有机溶剂萃取用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如，用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶；用苯酚萃取RNA由于有机溶剂简洁引起酶蛋白和酶RNA010的低温条件下进展，并要尽量缩短酶与有机溶剂接触的时间。双水相萃取双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。双水相萃取中使用的双水相一般由按肯定百分比组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成。在双水相系统中，

23、蛋白质、RNA 等在两相中的溶解度不一样，安排系数不同，从而到达分别超临界萃取的一种萃取技术物质在不同的温度和压力条件下，可以以不同的形态存在，如固体(S)、液体(L)、气体(G)、超临界流体(SCF)等。目前在超临界萃取中最常用的超临界流体是CO2。反胶束萃取：反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分别纯化技术。反胶束，又称为反胶团，是外表活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚拢体。反胶束溶液是透亮的、热力学稳定的系统胶束与反胶束的形成：将外表活性剂溶于水中，并使其浓度超过临界胶束浓度，外表活性剂就会在水溶液中聚拢在一起而形成聚拢体。通常将在水溶液中形成的聚拢

24、体胶束，称为正胶束假设将外表活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚拢体， 这种聚拢体称为反胶束中。其次步，在最正确条件下，将酶蛋白从反胶束转移到其次种水相的，马上酶从有机相中提取出来。 最常用的是阴离子外表活性剂。第九节结晶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进展结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越简洁进展结晶盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电点结晶第十节 酶的浓缩、枯燥浓缩:从低浓度溶液中除去局部水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过程。枯燥方法：真空枯燥、冷冻枯燥、喷雾枯燥、气流枯燥、吸附枯燥使酶催化特性得以改进的技术

25、有很多，主要有：酶分子修饰(enzyme molecule modification)技术、酶固定化(enzyme immobilization)技术、酶的非水相催化(enzyme catalysis in non-aqueous phase)技术、酶的定向进化(enzyme directed evolution)技术等第六章 酶分子修饰酶分子修饰的方法第一节 酶分子的主链修饰的方法，称为酶分子主链修饰一、主链的切断修饰主链切断后可能消灭三种状况1酶中心被破坏，催化功能丧失2催化功能保持不变或损失不多，抗原性降低3有利于酶活性中心的形成，催化功能提高多酶融合体：具有两种或多种催化活性的酶双头酶

26、：一条主链具有两种酶活性的酶其次节 酶分子的侧链基团修饰承受肯定的方法一般为化学法使酶蛋白的侧链基团发生转变，从而转变酶分子的特性和功能的修饰方法。侧链修饰的意义：蛋白类酶和核酸类酶的侧链基团不同，修饰方法也有所区分1酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的 氨基酸残基上的功能团。侧链基团一旦转变将引起酶蛋白空间构象的转变，从而转变酶的特性和功能。2RNARNA 的侧链基团是指组成RNARNA 分子上的侧链基团主要包括磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基酮基等。酶的侧链基团修饰方法主要有：氨基修饰，羧基修饰，巯基修饰，胍基修饰，酚基修饰，咪唑基修饰， 吲哚基修饰，分子内交联修饰等。大分子

27、结合修饰的作用：(1)通过修饰提高酶活力:：(2)通过修饰可以增加酶的稳定性： (3)通过修饰降低或消退酶蛋白的抗原性第三节 酶的组成单位置换修饰一、酶分子组成单位修饰的作用1、通过修饰可以提高酶活力2、通过修饰可以增加酶的稳定性3、通过修饰可以使酶的专一性发生转变4置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变是指在DNA工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。点突变技术用于酶分子修饰的主要过程：1、的酶分 子构造的设计基因序列分析、蛋白质构造分析、酶活性中心分析2、突变基因碱基序列确实定3、突变基因的获得引物设计进展基因定点突变PCR 技术4、酶的获得酶基因克隆表达、变异特性分析第四节 酶的金属

28、离子置换修饰修饰。酶分子中所含金属离子往往是酶活性中心的组成局部。假设从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。假设重参加原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者局部恢复。假设用另一种金属离子进展置换，则可使酶呈现出不同的特性。第五节 酶分子的物理修饰酶修饰后的性质变化1、热稳定性 2、抗原性 3各类失活因子的抵抗力 4、半衰期5最适pH6、Km的变化第七章 酶固定化酶在生产实践中的一些缺乏之处：1酶的稳定性较差2酶的一次性使用3产物的分别纯化较困难固定化酶的优缺点优点：(1) (2)可以长时间、反复使用，有利于工艺的连续化、管道化(3)酶反响过程可严格把握，有利于工艺自动化和微

29、电脑化。(4)在绝大多数状况下提高了酶的稳定性。较能适应于多酶反响。酶的使用效率、产物得率提高，质量有保障，本钱低。缺点：(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的本钱，使工厂开头投资大。(2)比较适于水溶性底物和小分子底物。(3)与完整细胞比较，不适于多酶反响，特别是需要辅因子的反响。(4)对胞内酶需经分别后才能固定化。第一节 固定化方法一五大类方法：吸附法 结合法 交联法 包埋法 热处理法二选择方法依据：1、 酶的性质 2 、载体的性质 3 、制备方法对酶的影响三固定化后酶的考察工程：、测定固定化酶的固定化率以及酶活力回收率。、考察固定化酶稳定性、考察固定化酶最适反响条件二、酶

30、的固定化方法一 吸附法简称吸附法。选择载体的原则：1要有巨大的比外表积2 要有活泼的外表3 便于装柱进展连续反响。物理吸附法常用的固体吸附剂有：活性炭 氧化铝硅藻土 多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、硅胶 羟基磷灰石、 金属丝网等影响吸附的因素主要有： 酶分子外表的电荷 介质中离子强度pH 温度蛋白质浓度及酶和载体的特性酶分子外表的电荷通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷，能有效的抑制固定化酶的解吸作用。吸附法的优点 ：操作简洁、条件温存。可选择的载体种类多。吸附过程可以同时纯化酶。固定化酶在使用过程失活后可重活化。载体可以回收再利用。吸附法的缺点：某些吸附过程的机理还不是格外明白，在给酶量、

31、吸附程度以及固定化酶活力回收等方面的不行预见性大。易脱落，影响产物纯度和酶的操作稳定性。二包埋法1、凝胶包埋法载体： 琼脂凝胶 海藻酸钙凝胶 角叉菜胶明胶聚丙烯酰胺凝胶2、半透膜包埋法常用半透膜：聚酰胺膜 火棉胶膜包埋法的特点优点：包埋法操作简洁，由于酶分子只被包埋，未受到化学反响，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。缺乏：只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜；同时，凝胶网络对物质集中的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。(三)结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。1、离子键结合

32、法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。2、共价键结合法：所用载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。重氮法 叠氮反响 3 溴化氰法 烷基化法四交联法菌体或菌体碎片的固定化。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。五热处理法将含酶细胞在肯定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格把握好加热温度和

33、时间，以免引起酶的变性失活其次节 固定化酶的特性一、稳定性 二、最适温度 三、最适pH 值 四、底物特异性第八章 酶的非水相催化非水介质：有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质等一、有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化是指酶在含有肯定量水的有机溶剂中进展的催化反响。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够根本保持其完整的构造和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。二、气相介质中的酶催化气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进展的催化反响。 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反响。特点三、超临界流体介质中的酶催化超临界介质中的酶

34、催化是指酶在超临界流体中进展的催化反响。用于酶催化反响的超临界流体应具有的特点对酶的构造没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响； 具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；超临界温度不能太高或太低，最好在室温四周或在酶催化的最适温度四周； 超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；超临界流体要简洁获得，价格要廉价等四、离子液介质中的酶催化离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进展的催化作用。离子液ionic liquids是由有机阳离子与有机无机阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点非水相

35、介质中酶催化的特点1、可以将加水分解反响转为其逆反响2、酶的热稳定性高3、简洁回收和反复利用4、转变酶对底物的专一性5、提高有机化合物尤其是非极性底物的溶解度6、低沸点溶剂中可简洁分别纯化产物7、能抑制依靠于水的某些不利反响8、没有微生物的污染9、非水系统中酶不易脱离吸附外表，易于酶的固定化胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，参加外表活性剂后 酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反响在胶束的两相界面中进展。反胶束又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，参加外表活性剂后形成的油包水的微小液滴。外表活性剂的极性端朝

36、内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反响时， 酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反响在两相的界面中进展其次节 水对非水相介质中酶催化的影响酶在完全非水环境中没有催化活性 酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反响速度等都有亲热关系，水还与酶催化作用的底物和反响产物 的溶解度有关一、水与酶的柔性酶分子有相对刚性和柔性两个局部依据酶与底物的诱导契合原理，酶活性局部保持肯定的柔性是酶表现其催化活性所必需二、结合水在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。在一般状况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加三、水活度Aw是指在肯定温度和压力下，反响体系中水的摩尔分

37、数 w wAw= w w在低压条件下，水活度Aw 是气相中水的分压与同温度下纯水的蒸气压的比值Aw=(Yw P) / P0 = Pw / P0影响更为准确。在给定的有机溶剂中，水活度随水含量的增加而增大； 对于给定的Aw，疏水性溶剂所需的水量比亲水性溶剂要少四、水对酶活力选择性的调整 但是水活度对酶活力的影响程度随着溶剂的不同而不同P1808-3水对酶的立体选择性也有肯定的调整作用 第三节 有机溶剂对有机介质中酶催化的影响(1)有机溶剂对酶构造与功能的影响：有些酶在有机溶剂的作用下，其空间构造会受到某些破坏，从而使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。A 有机溶剂对酶分子外表构造的影响：酶

38、在有机介质中与有机溶剂接触，酶分子的外表构造将有所变化B 有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响：当酶悬浮于有机溶剂中，有一局部溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点， 降低底物结合力量，从而影响酶的催化活性。有机溶剂分子进入酶的活性中心，会降低活性中心的极性，可能降低酶与底物的结合力量。有机溶剂对酶活性的影响：有些有机溶剂，特别是极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP 表示。P 是指溶剂在正辛烷与水两相中的安排系数。极性系数越大，说明其极性越小；反之

39、极性系数越小，则极性越强。lg P 2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使用。有机溶剂对底物和产物安排的影响：第四节 非水相中酶催化的特性一、热力学稳定性二、酶的特异性1、底物选择性：异性会发生转变。不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的有机介质中，酶的底物专一性也不一样。在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物简洁反响；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物简洁反响2、立体选择性又称为对映体选择性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的力量大小的指标。3、位置选择性和化学选择性4、其他特性分子记忆：依据分子识别理论， 酶通过配体的诱导、相互作用转变酶的构象，从而获得与配

40、体类似物结合的力量，这种由配体诱导产生的酶的记忆的方法称为分子记忆pHpH 环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液 pH 值一样。这种现象称之为pH第五节 非水相中酶催化反响的条件及其把握氧化复原反响、裂合反响等。酶在有机介质中的各种催化反响受到各种因素的影响：酶的种类和浓度、底物的种类和浓度、有机溶剂的种类，水含量、温度、pH1、酶的选择在酶催化反响时，通常酶所作用的底物浓度远远高于酶浓度，所以酶催化反响速度随着 酶浓度的上升而上升，两者成正比2、底物的选择和浓度把握 3、有机溶剂的选择 4、水含量的把握 5、温度把握 6、 pH第十章 酶反响器评价标准：反响器生产力量的大小和产品质

41、量的凹凸第一节常见的酶反响器类型按构造区分搅拌罐式反响器鼓泡式反响器填充床式反响器流化床式反响器膜反响器喷射式反响器按操作方式区分分批式反响连续式反响流加分批式反响混合形式连续搅拌罐反响器分批搅拌罐反响器一、搅拌罐式酶反响器1、分批搅拌罐式反响器。其特点是：底物与酶一次性投入反响器内，产物一次性取出；反响完成之后， 固定化酶细胞用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反响。2、 连续搅拌罐式反响器 同时，以一样流速输出反响液含产物。二、 填充床式反响器优点：高效率、易操作、构造简洁等，因而，PBR 是目前工业生产及争辩中应用最为普遍的反响器。它适用于各种外形的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反响。缺点：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时，不宜承受PBR。四、 鼓泡式反响器鼓泡式反响器(bubble column reactor, BCR)是利用从反响器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到供给反响底物和混合两种作用的一类反响器。也是一种无搅拌装置的反响器。物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反响中常用的一种反响器。五、 膜反响器 制成的一种生物反响器。六、喷射式反响器各种酶反响器的特点其次节 酶反响器的选择和使用影响酶反响器选择的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑：酶的形式(游