门冬酰胺合成酶启动子区单核苷酸多态性与基因表达量的相关性研究

1、门冬酰胺合成酶启动子区单核苷酸多态性与基因表达量的相关性研究罗长缨李本尚帖利军顾龙君【关键词】急性白血病；门冬酰胺合成酶；启动子区；单核苷酸多态性keyrdsauteleukeia;asparaginesynthetase;prtrregin;singlenuletideplyrphis材料和方法研究对象82份白血病患儿骨髓标本取自诱导缓解治疗之前，其中3份为复发白血病标本。临床病例包括ALL53例，ANLL26例，L3例。骨髓形态学检查显示，4份标本的幼稚细胞比例低于70%，8份在70%-80%之间，剩余70份标本的幼稚细胞比例均在80%以上。非白血病标本45份，其中6份为骨髓，其余为外周血

2、。研究方法基因组DNA抽提用TRIZL试剂Invitrgen公司产品抽提骨髓标本总RNA，同时抽提DNA。外周血标本的DNA用酚氯仿法抽提。骨髓细胞RNA提取及DNA合成骨髓单个核细胞按TRIZL试剂说明书提取总RNA。RNA沉淀用含无RNase的DNaseI溶液TaKaRa，体系为每50l溶液中，10DNasEibuffer5l,DNaseI(5U/l)2l,RNaseinhibitr(40U/l)0.5l,其余为DEP水重悬并根据吸光值调整浓度至1g/l。37孵育20分钟后置冰裕每份标本取2l模板进展反转录。反转录体系20l,模板2l先70变性10分钟，再参加18l反转混合物各成分及浓度按

3、Prega试剂说明，45延伸45分钟。最后95加热5分钟。反转录产物用双蒸水稀至100l保存在-20。ASRNA的实时荧光定量PR/Taqan探针法测定AS和内参照GAPDH的DNA序列从GenBank获龋探针和引物序列表1用PrierExpress2.0软件设计后由TaKaRa公司合成标记。实时定量PR的体系为25l:5Buffer5l,dNTP0.3l/L,g2+5l/L,ExTaqHS(5U/l)0.25l,DNA5l,引物各0.3l/L，探针0.12l/L。循环条件：955分钟激活ExTaq酶，然后每个循环9515秒，60退火加延伸45秒，进展45个循环。标准曲线用HepG2细胞的DN

4、A以14倍比稀释建立，标准品模板和待测模板均以复管进展扩增。扩增反响在ABIPris7000序列探测仪上进展。AS和内参照的起始模板量值用相对定量双标准曲线法分别算出。ASRNA的定量用AS的起始模板量除以内参照的起始模板量的比值表示。统计学处理各SNP在不同标本组中的频率分布差异用R表、2检验。各组间ASRNA定量差异用成组多样本秩和检验。结果AS基因转录控制区SNP的检测3个SNP位点在白血病和非白血病患儿基因组中的分布频率-239/T和-62A/T的基因型频率和等位基因频率在白血病和非白血病组之间无显著差异。-92G/A各基因型频率和等位基因频率在白血病和非白血病组间存在统计学差异两种频

5、率的P值均为0.012，其变异型等位基因A在白血病组的发生率高于非白血病组表2。-92A变异型等位基因在淋、髓两系白血病患儿的频率均高于非白血病组P值分别为0.041和0.01。而两系白血病之间的-92G/A两种频率比拟没有差异P值分别为0.446和0.422表3和表4。根据AS启动子片段中SNP基因型ASRNA程度的分组比拟-239/T、-92A/T、-62A/T3个变异位点并不存在连锁不平衡，因此我们按每个SNP位点的不同基因型对ASRNA进展分组，统计分析各组间ASRNA程度差异。-62A/T的T等位频率很低，总共只有3例A/T杂合子，所以我们仅对-239/T和-92A/T2个位点的SN

6、P各基因型ASRNA的转录程度进展差异分析，对白血病和非白血病两组共88份标本同时进展了测序和ASRNA的测定，这些标本是合并进展统计分析的。-239/T位点各基因型个体间的ASRNA表达程度没有统计学差异。而-92A/T位点的3种基因型的ASRNA表达存在统计学差异，其杂合子GA型的ASRNA表达程度最高，其次为变异型纯合子AA型，野生型纯合子GG型的ASRNA程度最低表5。讨论在我们所筛查的范围中共发现3处SNP。在对3个SNP的频率统计中，我们发现-92A等位基因型在白血病中的发生率显著升高。通常发现1种SNP在两组中存在分布频率差异有3种可能的原因：由于抽样误差导致的假阳性结果；该SN

7、P位点与疾病相关基因存在连锁不平衡；SNP位点所在基因就是疾病相关基因。白血病是一种影响基因组DNA重组修复和细胞增殖分化凋亡等系统或途径的多基因疾病，其受累的主基因可能有上百条。这些基因间又互相牵制形成复杂的功能网络，单个基因的变异作用微小，疾病的某一性状往往是一系列主基因上的变异组成的SNP群产生的结果。因此虽然我们不能完全排除抽样误差的可能性，但后两种可能性也是存在的。首先，AS蛋白涉及细胞周期的调控。人的AS基因最初被克隆和定位是在寻找G1期调控相关的功能基因时完成的，AS突变致蛋白功能缺失，导致ts11细胞停滞在G1期，转入含有后来被确认为相当于人AS基因的序列后使得ts11细胞的周期得以完成9。而癌症的发生无不伴随这种或那种细胞周期调控基因的功能改变。因此我们不能完全排除AS基因中某个核苷酸的变异导致白血病等癌症发生几率增加的可能性。反过来解释，由于癌症细胞的修复系统功能异常所导致的基因组不稳定，可能导致单个变异型核苷酸的发生几率高于正常细胞。本研究对-92G/A位点SNP各基因型个体的AS表达程度统计分析结果显示，基因表达程度由高到低依次为GA杂合子型AA纯合子型GG纯合子型。由