丁基苯酞对老化果蝇作用的实验研究

1、丁基苯酞对老化果蝇作用的实验研究【关键词】阿尔茨海默病；丁基苯酞；黑腹果蝇；淀粉样蛋白1材料与方法1.1材料1.2方法1.2.1果蝇模型1.2.1.1杂交获得实验果蝇以eb雌性处女果蝇分别与S雄性果蝇、38雄性果蝇杂交，79d后移除所有亲本，观察到有子代果蝇成虫羽化为第1天，连续搜集3d雄性子1代果蝇，分别为eb/s雄性子1代果蝇简称seb，野生果蝇、eb/38雄性子1代果蝇简称38eb，AD果蝇，作为实验果蝇。1.2.1.2AD果蝇的检测除对果蝇形态性状进展识别外，解剖果蝇脑组织，免疫组化定性检测果蝇脑组织中的A表达6，在荧光显微镜下38eb中检出了A的表达，seb中未检出。见图1、图2。1

2、.2.1.4实验分组果蝇分为生存时间观察单元、行为测量单元、ATP测量单元和备用单元。除行为测量单元设置6管外，其他单元每果蝇类型、每剂量组设置5管，每管饲养果蝇20只。期间各单元假设有果蝇损失，以备用单元一样果蝇补充。1.2.2指标测定1.2.2.1生存时间每3d计数1次果蝇存活及死亡数，直至果蝇全部死亡5。1.2.2.2果蝇行为实验利用果蝇逆重力爬行的生理特性，在暗室红光下，将20只果蝇垂直震落于一干净指管底部，迅速翻开管塞，开口处对接另一只干净指管，20s后观察并计录位于上管的果蝇数量5。爬行行为4d测试1次，每次每管连续测量6次，记录整数平均值，实验持续到果蝇数量缺乏以完成实验。2结果

3、2.1果蝇生存时间seb果蝇各组寿命差异无统计学意义P=0.116，38eb果蝇各组寿命差异无统计学意义(P=0.922)。2.2果蝇运动行为实验2.2.1seb果蝇行为评分结果果蝇运动行为程度随着时间增加而下降P0.01。各组随时间因素下降的幅度不同P0.01见图3。在同时间点的两两比拟中，14d，药物各组均高于对照P0.05；18d，药物各组均高于对照P0.05，药物组间比拟10.0l/L组高于0.3及1.0l/L组(P0.05)；22d，药物各组均高于对照P0.05，药物组间比拟，10.0l/L组高于其他组P0.05,3.0及1.0l/L组高于0.3l/L组P0.01。见表1。2.2.2

4、38eb果蝇行为评分结果果蝇运动行为程度随时间增加而下降P0.01。各组随时间因素下降的幅度不同P0.01(见图4)。在同时间点的两两比拟中，14d，药物各组均高于对照(P0.05)，药物组间比拟3.0及10.0l/L组高于0.3l/L组P0.05,3.0l/L组高于1.0l/L组(P0.05)；18d，3.0及10.0l/L组高于对照及0.3l/L组P0.05；22d，3.0l/L组高于对照及其他药物组P0.05。见表2。2.3果蝇脑组织的ATP值测定结果表1seb果蝇爬管行为实验评分同时间点比拟：1)P0.05，同时间点与0.3l/L组比拟：2)P0.05，同时间点与1.0l/L组比拟：3

5、)P0.05，同时间点与3.0l/L组比拟：4)P0.05，表2同表238eb果蝇爬管行为实验评分2.3.1seb果蝇对照组ATP值明显多于NBP各组P0.01,NBP各组间差异无统计学意义P0.05，见图5。2.3.238eb果蝇0.3l/L组高于对照组P0.05。其他组与对照组差异无统计学意义P0.05。见图5。转贴于论文联盟.ll.图438eb爬行行为实验重复测量均数趋势变化图1：对照组，2：NBP0.3l/L组，3：NBP1.0l/L组，4：NBP3.0l/L组，5：NBP10l/L组图5出生17d果蝇脑组织ATP含量3讨论AD临床表现记忆力障碍、认知障碍、精神病症等，呈进展性神经退行

6、性变，典型者出现病症后510年死亡。2022年统计全球现有2430万痴呆患者，每年新发约460万例，而AD约占所有痴呆的50%60%8。一个系统评价指出,我国20012022年60岁及以上人群AD患病率达2.2%3.2%，各类痴呆及AD患病率呈逐年上升趋势9。AD已成为一个严重的公共卫生问题。目前AD主流治疗药物有乙酰胆碱酯酶AhE抑制剂、胆碱受体冲动剂及NDA受体拮抗剂等10。其主要理论根据为AD患者脑内胆碱能神经元明显减少，由于其与记忆等功能亲密相关，进步相应递质程度在理论上能获得AD病症缓解的效果。在临床试验中，这些药物也显示出了一定疗效11，12。但某些研究显示，AD除影响胆碱能神经元

7、，还可能影响了儿茶酚胺能神经元，或与谷氨酸能有关13。在临床上主要适用于轻、中症患者，能使局部病症缓解，但无法阻止病情的进展性进展10。无论是特异性或效能都有限，因此，有人认为在AD治疗上补充递质这种手段似乎已经走到了尽头13。另外，补充治疗也许能补充某些递质缺失，但无法补充缺失的神经细胞所有功能，且针对的是病变终末环节，治疗最大效果有限。随着AD经典病理认识老年斑和神经纤维缠结的核心成分A和tau蛋白逐渐明晰，目前普遍认为，A广泛地联络了AD病理的各个阶段，是AD的中心病理环节。因此，当前许多药物研发都是以A直接或间接为靶点14。但是，最近一项A42疫苗治疗的临床报告说明，虽然有利于去除脑内

8、淀粉样斑块，但对痴呆病症和生存时间并未有明显改善15。提示在晚期患者中，A的直接策略也许并非最正确选择。采取治疗早期损害的间接策略也许是一种可行思路。与其他神经退行性变疾病类似，在AD中发现不仅神经轴突合并线粒体功能受损4，线粒体也可直接成为A的损害目的，使其能量代谢和ATP转运受到影响16，17。由于线粒体在细胞能量代谢的重要地位，可理解为线粒体的损害已成为AD亚细胞程度损害的核心。假如能针对AD的线粒体损害环节入手，不失为一个很有希望的治疗策略。本实验所讨论的NBP已在根底研究中证实可改善线粒体能量代谢，稳定线粒体复合酶，逆转线粒体膜的流动性降低，并使线粒体膜电位和总ATP酶的活性恢复正常

9、2，3。有理由推测NBP可能对AD损害的线粒体有益。采用AD果蝇模型初步挑选NBP作为AD的候选药物，设计A过度表达来模拟A的产生增多，脑组织内检出A免疫组化斑点，提示老年斑形成；较正常果蝇加速出现的行为活动才能的下降数据未给出可模拟行为的进展性退变，在大量实验的根底上，如有延缓或改善，可提示进展性神经退变有所延缓。生存寿命变化作为整体指标，但如出现明显延长，可提示药效异常显著，且具有判读明确、能大量分析等优势。脑组织ATP测定也是一个客观理解果蝇脑组织能量代谢的指标，间接反响线粒体的相关功能，提示是否存在对脑组织线粒体的相关作用。从实验结果来看，NBP对AD果蝇能延缓爬行活动才能下降，同时间

10、点比拟，药物浓度和效应存在一定量效关系。提示药物对AD的进展性运动行为下降有延缓作用。这一行为改变机制复杂，可能与中枢神经系统的复杂调控及外周肌肉功能均有关。由于寿命影响的混杂因素较多，药物在生存时间改善方面效果不佳。另外，NBP一定剂量能增加AD果蝇脑组织ATP含量的相关作用。间接说明NBP对AD果蝇脑组织线粒体的正向作用，使ATP相对增多。以上结果与已发表的细胞实验结果提示NBP能减少A导致的细胞凋亡，减少引起tau蛋白磷酸化相比。有一定同向性18。笔者注意到，NBP干预对照果蝇的一些结果，一般衰老果蝇的运动行为才能下降得到了一定延缓，但脑组织ATP量在应用NBP干预的正常衰老果蝇中表现出了下降。分析可能与对照果蝇自然老化过程本身的复杂变化及NBP的脂溶性、多靶点作用有关。这些效应对于外周神经肌肉接头的线粒体作用可能较单一，优势结果表现为运动行为才能的改善。但在中枢过程中综合效应可能适得其反。而在AD果