马棘70%醇提取物对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

1、马棘70%醇提取物对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响【摘要】目的讨论马棘70醇提取物IP的抗动脉粥样硬化作用及机制。方法用不同浓度的马棘、肝素孵育体外培养的小鼠单核巨噬细胞RA264.712h后，参加氧化低密度脂蛋白X-LDL作用，用免疫组化和逆转录聚合链反响RT-PR分别检测IP对低密度脂蛋白受体LDL-R蛋白和RNA表达的影响。结果马棘能明显降低小鼠单核巨噬细胞RA264.7的LDL-R蛋白和RNA表达，且对X-LDL引起的LDL-R表达降低有保护作用。结论马棘具有降低巨噬细胞LDL-R的表达和逆转X-LDL的作用，这可能是其抗动脉粥样硬化的重要作用机制。【关键词】马棘巨噬细胞低密度

2、脂蛋白Abstrat：bjetiveTexplretheantiathergeniehanisfalhlextratfrIndigferapseudtintriaatsu(IP).ethdsTheellasinubatedithdifferentnentratinfIPrheparinfr12hthatasestablishedbyulturinguseaphageRA264.7,thenX-LDLasaddedintultureplate.TheexperientasterinatedafterX-LDLtkatinfr24h.TheexpressinsfLDL-RprtEinandRNAe

3、redeterinedbyiunhistheistryrRT-PR,respetively.ResultsTheexpressinfLDL-RprtEInandRNAinusearphageRA264.7asreduedafterbeinginubatedithX-LDLfr24h.IPreinfreentedtheexpressinsfLDL-RprteinandRNAhiherereduedbyX-LDL.nlusinX-LDLaninhibittheexpressinfLDL-RprteinandRNAinarphage.IPanreversethiseffetfX-LDL.Thisay

4、benefantiathergeniehanis.Keyrds：Indigferapseudtintriaatsu(IP)；arphage；Ldensitylipprtein马棘Indigferapseudtintriaatsu，IP为豆科木篮属植物，以根或全株入药。又名一味药、野绿豆、马料梢、山皂角、野篮枝子。性味苦、涩，平，具有清热解毒、消肿散结之成效。用于感冒咳嗽，扁桃体炎，颈淋巴结结核，小儿疳积，痔疮；外用治疔疮。该植物广泛分布于全国各省市，资源丰富13。我们曾研究发现马棘醇提取部位具有显著镇痛作用4。本研究讨论70%马棘醇提物IP对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响。1材料与方法

5、1.1试剂与仪器Gib公司DEN培养基和小牛血清；抗LDL-R多克隆抗体武汉博士德生物工程；LDL中国协和医科大学根底生化所；大连宝生物工程逆转录系统和PRresyste；引物武汉博士德生物工程；小鼠单核巨噬细胞RA264.7中国协和医科大学细胞中心；其他试剂为国产分析纯。上海第三分析仪器厂722型分光光度计；日本lypus公司XDP-1倒置显微镜；SHELDNLAB公司T2323型2培养箱；依地酸EDTA，siga公司，3,3二氨基联苯胺DAB。1.2马棘醇提取物的制备5马棘枝叶采自湖北建始，经湖北民族学院鲁开功教授鉴定为豆科植物马棘IndigferaPseudtintriaatsu，IP，

6、经10倍量70%乙醇回流提取两次，过滤，浓缩蒸干，研末，收率为14.3%。1.3小鼠单核巨噬细胞RA264.7的培养6，7细胞培养瓶中接种RA264.7，调至pH7.27.4，含胎牛血清10、链霉素l105UL-1、青霉素1108UL-1的DEN培养液，通以5%2恒温37培养4872h，细胞交融后，用0.1胰蛋白酶和EDTA0.08%的混合消化液消化传代。实验前将细胞接种于细胞培养板，在无血清、无酚红的培养液中通以5%2，37，培养12h备用。1.4氧化低密度脂蛋白X-LDL的制备6,7将LDL置于恒温37、pH7.2的PBS溶液uS4，10lL-1透析24h，在含0.1%EDTA的PBS中透

7、析24h终止反响，0.22微孔滤膜过滤除菌备用。脂蛋白氧化修饰程度以硫代巴比妥酸反响物质值来表示。结果X-LDL为21.4lL-1，LDL为2.2lL-1，说明LDL被氧化。1.5动物分组共分6组，即：对照组ntrlgrup,G；X-LDL组X-LDLgrup,LG；肝素组100gL-1,heparingrup,HPG；IP100，200，400gL-1保护组IP-100,200,400。取细胞计数为1108个细胞L-1的备用传代培养细胞，按每孔500l接种于6孔板，每组5孔，12h细胞交融后，更换无血清无酚红DEN培养液，后4组HPG和IP-100,200,400分别参加相应浓度的肝素和IP

8、预处理，培养12h后，除G外，其余各组分别参加50gL-1X-LDL培养24h获细胞。1.6LDL-R表达的检测免疫酶标记法，SAB6取细胞爬片，内源性过氧化酶以3%H22灭活，用羊血清封闭，加兔抗鼠LDL-R一抗，4，次日加山羊抗兔lgG二抗；加SAB复合物，DAB-H22显色。脱水、透明、封片，镜下观察，阳性物呈棕黄色。以德国欧波同VIDAs图像分析系统分析实验结果，小鼠单核巨噬细胞RA264.7中LDL-R相对含量以细胞平均吸光度A值表示。1.7LDL-RRNA表达的检测逆转录聚合酶链反响，RT-PR7按Trizl试剂说明一步法提取各组细胞总RNA。取总RNA4l按试剂说明逆转录合成DN

9、A，取2l参加25l反响体系扩增，PR扩增条件为：94，5in；94，45s；52,45s,72，1in,30个循环，7210in。扩增后的LDL-R上游引物：5TATTTTTTATTG3，下游引物：5AGAGTTTGTTA3，合成360bp片断。内参照-肌动蛋白上游引物：5TATTTTAAT3，下游引物：5TAGTAAATGTAAA3，合成639bp片断PR产物。用1琼脂糖凝胶电泳显影，结果用天方凝胶图象分析软件分析，各组LDL-RRNA表达差异定量用各组目的基因与内参照基因的吸光度A比值来表示。1.8统计学分析各组数据采用s表示，配比照拟采用t检验。2结果2.1IP对RA264.7细胞LD

10、L-RRNA表达的影响各组细胞均有LDL-RRNA表达，X-IDL与小鼠单核巨噬细胞RA264.7作用24h后，能明显降低LDL-R的RNA表达，与G比拟，有显著性差异P0.01；IP-100,200,400gL-1均能进步LDL-RRNA的表达，且呈现浓度依赖趋势，以IP-400gL-1作用最强，与IP-100和200gL-1比照有显著性差异P0.05或P0.01.结果见图1及表1。表1IP对RA264.7细胞LDL-RRNA表达的影响略转贴于论文联盟.ll.2.2IP对RA264.7细胞LDL-R蛋白表达的影响LDL-R免疫组化结果显示，各组细胞均有LDL-R表达，表达强弱有明显差异；X-

11、LDL与RA264.7细胞作用24h后能显著降低LDL-R蛋白表达，与G比拟有显著差异P0.01；IP对X-LDL引起的LDL-R表达下调均有保护作用，以400gL-1组作用最强，与IP-100和200gL-1比照有显著性差异P0.01；肝素100gL-1对X-LDL引起的LDL-R表达下调无明显作用，与G相比无显著差异P0.05。结果见表2。表2IP对RA264.7细胞LDL-R蛋白表达的影响略3讨论动脉粥样硬化AS是心脑血管疾病的主要病理根底，其主要成因与脂质代谢紊乱有关8。流行病学及实验研究发现，血浆低密度脂蛋白LDL浓度与AS的发生呈正相关9。最新研究发现，LDL受体LDL-R对调节体

12、内的胆固醇平衡，降低血浆LDL浓度起关键性作用，因此LDL-R功能的缺陷和异常是引起脂质代谢紊乱主要原因10。LDL-R是一种细胞外表糖蛋自，能与血浆中两种致AS脂蛋白LDL和VLDL结合，介导内吞和胞内分解，所以LDL-R对调节血浆总胆固醇T)含量起着关键作用11。因此，通过调控LDL-R的活性控制高脂血症，可以预防AS的发生与开展9。LDL-R基因表达调控的分子机制是：转录程度LDL-R基因启动子的激活和抑制、胆固醇类分子的负反响抑制以及转录后RNA分子稳定性的进步与降低10。LDL-R基因转录的调控主要由胞内胆固醇负反响抑制性机制和非胆固醇分子介导，前者涉及胆固醇调节元件结合蛋白SREB

13、P1和SREBP2的合成及与LDL-R基因启动子胆固醇调节元件SRE1的结合11。当胆固醇浓度降低时，SREBP便结合到SRE1上，激活LDL-R基因转录，这一机制对于保持细胞的胆固醇平衡有重要意义10。非胆固醇介导的调控机制那么通过蛋白激酶EK/ERK信号转导进展，并与LDL-R基因启动子中的重复序列3有关9。本研究发现X-LDL可降低LDL-R表达，与有关报道一致8。其机制可能为细胞摄取X-LDL后，使胞内胆固醇浓度升高，通过由胆固醇介导的负反响抑制性机制，抑制了SREBP与SREi结合，进一步抑制LDL-R转录与翻译10。IP可逆转X-LDL对LDL-R的下调，而且呈现浓度依赖趋势。其作

14、用机制可能是：抑制泡沫细胞的形成，降低胞内胆固醇含量有关9，即通过降低胞内胆固醇含量，减少胆固醇介导的对LDL-R表达的负反响抑制性，而增加LDL-R的表达10；IP也可能通过蛋白激酶EK/ERK信号转导途径，干扰LDL-R的转录所致11。这可能是其抗AS的作用机制之一，其详细的作用机制尚有待于进一步讨论。【参考文献】1?全国中草药汇编?编写组.全国中草药汇编，上册.北京：人民卫生出版社，1975：84.2方志先，廖朝林.恩施药用植物志，上册.武汉：湖北科学技术出版社，2022：525.3张水利，朱伟英马棘皮的生药鉴定J.中药材，2001，241：28.4胡泽华.马棘不同提取部位对小鼠镇痛作用

15、的研究J.时珍国医国药，2022，18(10):2442.5孙文基.天然药物成分提取别离与制备.天津：中国医药科技出版社，1999：207.6汪韶君，刘赛，孙福生，等扇贝糖胺聚糖对巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响J.中国药学杂志，2022，423：184.7huangL,LIUSEffetfsallpskirtglysainglyannprliferatinfratvasularsthusleellsandtheatinfehanissJ.hinJPharalTxil，2022，15(l)：7.8hYP，slYL，yinLipidsandatherslersisJ.BiheellBil,2022,82(1)：212.9brnS，gldstEInJLAreeptr-ediatedpathayfrhlesterlhestasisJ.Siene，1986，232：34.10ngLI，fredriBK,thasEIndutinfldensitylipprteinre