Cajal间质细胞在先天性巨结肠分布的研究

1、Cajal间质细胞在先天性巨结肠分布的研究【摘要】目的：通过观察ajal间质细胞interstitialellsfajal，I在正常结肠及先天性巨结肠先天性巨结肠hirshsprungsdisease，HD患者痉挛段、移行段、扩张段的分布，讨论HD的发病机制。方法:搜集25例HD患儿标本，于术中分别选取扩张段、移行段、痉挛段肠壁的全层组织，另取6例手术患儿的正常结肠全层组织标本，常规固定石蜡包埋组织切片备用。对标本行-Kit免疫组织化学染色。光镜观察I的分布，计数并进展统计学分析。结果:正常结肠I主要分布在环肌内侧面与黏膜下层之间即黏膜下IsubusalI,I-S、环肌与纵肌之间的肌间神经从周

2、围即肌间IyenteriI，I-Y以及环肌与纵肌内。HD患儿痉挛段I-S、I-I细胞数较扩张段和正常对照组明显减少(P0.01)，且I的细胞突起的分支亦减少，彼此之间不能形成完好的细胞网络。而扩张段I与正常对照组比拟无明显差异(P0.05)。结论:HD患儿结肠I的异常分布，可能是HD发并肠管蠕动障碍以及排便异常的原因之一。【关键词】先天性巨结肠ajal间质细胞免疫组织化学【ABSTRAT】bjetive：TinvestigatetherlefinterstitialellsfajalIinthepathgenesisfHDthrughbservingthedistributinftheells

3、innrallnandHDsdifferentsegents.ethds:Theaganglini、transitinalanddilatedsegentserelletedinperatinsfr25hildrenithHirshsprungsdisease.Anther6nralsegengtserealslleted.Eahsetinsasstainedby-Kitiunhistheistry.Thedistributinftheinterstitialellsfajalasbservedbylightirspe.Results:TheIinaganglinisegentsflnfrHi

4、rhsprungsdiseaseeredereasedsignifiantlyandstatistiallythanthatindilatedandnralln.rever,hleuntpreparatinsshedthat,ntnlythenuberfI-Iasdereaseddn,butalsthebranhesfI-Iandtheellularnetrkerealsbrkendn.nlusin:ThepathgenesisfHDisrelatedttheabnraldistributinfI，hihleadtraggravatethebelspasinHD.【KEYRDS】Hirshsp

5、rungsdiseaseInterstitialellsfajalIunhistheistry先天性巨结肠Hirshsprungsdisease,HD是小儿普通外科常见病，由于病变肠段神经节细胞缺如，平滑肌过度收缩呈痉挛状态，蠕动消失，肠腔内粪便不能通过痉挛部位，近端结肠继发性扩张，形成巨结肠，临床上出现肠梗阻或便秘病症。1893年西班牙神经解剖学家ajal采用甲基蓝及嗜银染色法发现了存在于胃肠道的一种特殊类型的细胞,被称为ajal间质细胞interstitialellsfajal，I。I是胃肠道运动的起搏细胞，具有自发性电活动和产生传播慢波等功能，对胃肠道运动具有非常重要的调节作用。I的变化

6、与多种胃肠动力疾病有关。本研究通过-Kit免疫组织化学染色，光镜观察I在正常结肠和巨结肠患者扩张段、移行段、痉挛段的分布，讨论I在HD致病中的作用。1资料与方法1.1一般资料搜集山东省立医院、山东大学齐鲁医院2022年5月2022年10月25例HD患儿手术切除组织，其中男22例，女3例。平均年龄23个月，2周3个月4例，3个月3岁16例，3岁5例。长段型2例，短段型2例，其余均为普通型。所有病例综合临床表现、X线钡剂灌肠和手术所见，并经术中冰冻术后病理组织学检查确诊为HD，病例资料完好，均为散发。手术切除的扩张段、移行段、痉挛段全层肠壁组织经4%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，以扩张段组织蜡块作自

7、身对照。另取6例正常结肠组织作为对照，其中3例为乙状结肠冗长症患儿切除的局部结肠组织，2例为肠改变肠坏死患儿切除的局部升结肠组织，1例为回盲型肠套叠患儿手术切除组织。1.2主要试剂和方法兔抗人-Kit多克隆抗体IgG，购自上海长岛生物抗体；SP免疫组织化学染色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术。组织蜡块行SP法免疫组织化学染色。每个蜡块连续切片3张，厚34；切片常规脱蜡至水；3%过氧化氢去离子水室温孵育510in；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5in，微波抗原修复。正常山羊血清工作液封闭，室温孵育10in，倾去血清，勿洗；滴加1:50稀释的一抗，37孵育2h；PBS冲洗3次；滴加生物素标记羊抗兔IgG二

8、抗工作液，37孵育15in；PBS冲洗3次。滴加PBS稀释的辣根酶标记链霉卵白素工作液,37孵育15in；PBS冲洗3in，共3次；DAB显色，苏木精复染，封片。以试剂盒附送阳性片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。1.3观察指标由有经历的病理医师在高倍镜400下观察全部病理切片的肌间、黏膜下各10个视野，理解I的分布情况并计数。1.4统计学处理全部数据经SPSS13.0统计软件分析。HD扩张段、痉挛段与对照组行成组设计两样本均数比拟的t检验，扩张段与痉挛段之间行配对设计资料t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同结肠组织内I的分布正常结肠组织内可见两类-Kit阳性细胞

9、：一类细胞胞体较大，呈圆形，主要分布于黏膜层和黏膜下层，在肌层内和浆膜下分布稀少，根据形态可识别为肥大细胞图1。另一类细胞胞体较小，呈梭形或多角形；细胞质相对较多，可见棕色颗粒；核呈深蓝色，圆形或椭圆形，此为I。I细胞主要为多极细胞，少数为双极细胞，细胞有23个细长突起，彼此借突起互相连接。分布在纵肌与环肌之间的肌间神经从周围的I称之为肌间IyenteriI,I-Y)，细胞借突起形成网络状构造；位于黏膜下环形肌层外表的I称之为黏膜下IsubusalI,I-S)，细胞多为双极细胞，借突起互相连接于黏膜下层和环肌层形成明显的界面；分布在环饥纵肌内的I称之为肌内IintrausularI,I-I,有

10、的与平滑肌平行走行，有的与平滑肌穿插，数量较少，彼此之间未见互相连接图2。转贴于论文联盟.ll.I在HD患儿病变结肠各段的分布不同。扩张段病变结肠-Kit阳性表达细胞数量和形态与正常结肠无明显差异，根据形态可识别肥大细胞和I。I主要为I-Y和I-S，彼此之间互相连接形成网络状构造或形成一界面，I-I数量较少图3。痉挛段病变结肠-Kit阳性表达细胞明显减少,彼此之间的网络状构造被破坏，I-S亦明显减少，彼此之间连接消失；I细胞形态与扩张段和正常结肠相似，仍呈梭形或多角形图4。移行段病变结肠-Kit阳性表达细胞数量介于扩张段与痉挛段之间。2.2不同结肠组织内I数量的比拟正常结肠组织、HD扩张段、H

11、D痉挛段的I-Y数量分别为13.172.17、11.123.28、2.161.70；I-S的数量分别为6.561.18、8.332.16、1.881.56。正常结肠组织与HD扩张段I-Y数量比拟，差异无统计学意义t=1.0576,P=0.2990；I-S数量比拟，差异亦无统计学意义t=1.7915,P=0.0837。正常结肠组织I-Y和I-S数量均多于HD痉挛段，差异有统计学意义t=10.4325,P0.01；t=8.4433,P0.01。HD扩张段I-Y和I-S数量均多于痉挛段，差异有统计学意义t=9.3165,P0.01；t=9.7783,P0.01。3讨论HD是常见的小儿普通外科疾病，患

12、儿胃肠道平滑肌过度收缩甚至痉挛，蠕动消失，肠腔内粪便滞留，近端结肠继发性扩张，形成巨结肠，临床上主要表现为肠梗阻或便秘病症。I是胃肠道运动的起搏细胞，对胃肠道运动具有非常重要调节作用。HD患儿多伴有病变结肠组织I的缺如。既往应用甲基蓝和嗜银染色、金属掺合剂、NADPH黄递酶染色以及碘化锌四氧化锇酸法对I进展检测，但这些方法均缺乏特异性。真正的检测依赖于显微镜，这在一定时期内限制了对I的研究。I的基因表达产物-Kit可以作为一种化学标志物与其他细胞区别开。-Kit是酪氨酸激酶受体，具有细胞外、细胞膜和细胞质内3个局部。细胞外的局部为肝细胞因子steellfatr，SF的受体区,细胞内局部为酪氨酸

13、激酶区。SF与-Kit结合活化了酪氨酸激酶,导致一系列磷酸化过程,从而影响细胞的生长和分化。人类肠道组织中-Kit免疫组织化学染色仅能标记两种细胞，即肥大细胞和I。本研究发现，正常结肠组织内-Kit阳性细胞有较高的表达率，主要分布于肌间和黏膜下，密度明显高于环肌与纵肌内。通过形态可以区别肥大细胞和I，肥大细胞较大呈圆形，具有圆形的细胞核，细胞质丰富。I呈梭形，多为多极细胞，少数为双极细胞，具有卵圆形细胞核。位于肌间的I彼此借突起互相形成网络状构造，黏膜下的I连接形成一明显的界面。胃肠运动依赖神经元、I和平滑肌细胞的正常功能。I产生的根本电节律起关键作用。I是胃肠慢波活动的起搏器。Kh等将在别离

14、培养的Balb/小鼠的小肠I上用膜片钳技术记录到了有节律性、规那么的慢波样去极化波形，其波形与宽度均与胃肠道平滑肌肌条上记录的慢波相似。但小肠I与平滑肌细胞电生理特性不同，I在膜电位时即表现出自发性电压振荡vltagesillatin，节律性电活动不被超极化和L-型钙通道阻滞剂所阻断；而平滑肌细胞无自发性电活动，仅表现为电压敏感性动作电位vltagesensitiveatinptential，可被超极化和L-型钙通道阻滞剂抑制-。结肠肌层I细胞培养电生理研究发现，I属兴奋型细胞，有自发性节律性电活动，阈值明显低于平滑肌细胞，推测I为胃肠电活动的起搏细胞。I也是肠神经和平滑肌之间的中间媒介。研究

15、说明，肠肌丛I与运动神经元相联络。I通过与平滑肌细胞的电藕联关系，传递神经冲动。I也能释放某些神经递质，如神经肽，直接影响平滑肌细胞的相应受体。I与神经节细胞关系亲密。胚胎时期，I的分化和成熟需要-Kit的配体，后者由神经元或其他细胞产生。本研究发现痉挛段肌间和黏膜下I数量较扩张段和正常结肠明显减少。尚不清楚是由于神经节细胞的减少引起了I的减少，或者相反，还是某种共同的因素导致了二者的同时减少。目前研究认为HD胚胎基质的某种缺陷不仅损害了神经节细胞的移行，也影响了I的分化和成熟，致使生后某段肠管神经节细胞缺如，同时病变肠管I数量和I网络异常，但详细的原因还不清楚。刘浩等研究-Kit及SF在儿童

16、贲门失缓和症的分布，发如今远端食道及胃底部，-Kit样纺锤体型细胞的分布与对照组根本一样，但在贲门部明显稀疏或缺如。atanabe等研究发现，儿童贲门失缓和症与食管下端括约肌leresphagealsphinter，LES内的I承受抑制性氮能神经传导减少有关。慢性假性肠梗阻也被认为与I的减少有关。Jain等发现慢性假性肠梗阻患者小肠壁Kit阳性I消失。慢传输型便秘的患者结肠I明显减少，细胞体积缩小，包括纵肌层IIlngitudinalusle，IL、环肌层IIirularusle，I等。本研究发现，在正常结肠组织和HD扩张段分布大量-Kit阳性I，彼此间借细胞突起相连接，在肌间形成网络状构造，

17、在黏膜下互相连接形成一明显的界面，在环纵肌内通过树状构造与肌细胞相连。I在神经丛内主要分布于外周，与平滑肌细胞严密相连；在黏膜下边缘与神经丛伴行。HD无神经节细胞肠段肠壁内-Kit阳性的I细胞数目明显减少。在痉挛段I形成的网络状构造不明显或消失，提示I之间及其与平滑肌细胞的电藕联遭到破坏。推测HD患儿I的正常功能遭到破坏，导致肠道运动功能紊乱，失去正常的蠕动功能，从而使大便排出受阻，发生远端肠管痉挛狭窄和肠梗阻。然而HD是一种多病因疾病，很多问题不能用I缺如的单一因素解释。例如：HD术后已经切除至神经节细胞正常肠段，患儿为什么还存在小肠结肠炎、便秘、污粪等并发症？是否还存在其他发活力制是否涉及

18、其他与肠道运动相关的因素？这些问题都有待于深化的研究。【参考文献】1HuizingaJD,ThunebergL,Kluppel,etal./KitgenerequiredfrinterstitialellsfajalandfrintestinalpaeakerativityJ.Nature,1995,3736512:347-349.2KhSD,SandersK,ardS.SpntaneuseletrialrhythiityinulturedinterstitialellsfajalfrtheurinesallintestineJ.JPhysil,1998,513Pt1:203-213.3SandersK.AasefrinterstitialellsfajalaspaeakersandediatrsfneurtransissininthegastrintestinaltratJ.Gastrenterlgy,1996,1112:492-515.4LeeJ,ThunebergL,Berezin1,etal.Generatinfslavesinebraneptentialisanintrinsiprpertyfinterstitialellsfaj