生化技术原理期末考试复习重点

1、第一章1：与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 2：生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 建立相应的可靠分析测定方法，是制备生物大分

2、子的关键。 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 产物的浓缩，干燥和保存。3：分析测定的方法主要有两类： 即生物学和物理、化学的测定方法。 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。 实际操作中尽可能多

3、用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。4：生物大分子的分离纯化方法有多种，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： 利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； 将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。 5：需了解的生物大分子物理、化学性质,主要有： 1、在水和各种有机溶

4、剂中的溶解性。 2、在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 3、固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4、各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 5、其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 6、对其他生物分子的特殊亲和力。6：为什么要细胞破碎细胞是生物体结构和功能的基本单位，通常人们所需的物质有些分泌于细胞外，如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌细胞外的培养液中，用通常的溶剂可自接提取；有些则存在于细胞内，这类酶又有游离酶和结合酶之分，前者游离在细胞质中，后者则与细胞器紧密结

5、合(如氧化还原酶和有机磷水解酶等)。欲提取存在于细胞内的物质时、必须把细胞破碎。细胞破碎的阻力跟细胞结构有关。7：纯化方案 是指在纯化某一物质过程中，将几种分离方法有机地互补联合、灵活应用的总称。它既是从各类材料中提取分离有效成分的前提，又是成功地达到纯化目的之保证。8：纯化方案的评价对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价，而这种评价仅采用理论分析是远远不够的，只有经过实践检验才能正确得出。其方法是，对纯化过程的每一步收集到的溶液都要进行有效成分的含量测定，并将各自的比活力(活力单位数/毫克蛋白)、纯化倍数(每步的比活力粗抽提液的比活力)和收得率计算出来。视纯化倍数的大

6、小，收得率的高低，就能初步确定每种分离方法的应用价值。一般认为，凡是在特定实验中能增大纯化倍数和提高收得率的方法均属有应用价值的，反之，则应用价值不大。实践中对纯化倍数和收得率的要求是依据材料来源的难易而变化的。若材料来源难，就希望提高收得率；反之，则希望提高纯化倍数(见沉淀法)。9：蛋白质纯度的鉴别标准蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。蛋白质纯度的鉴别有下列几点要求： 蛋白质在不同pH条件下的电泳，均呈现一条分离区带。 蛋白质等电点聚焦电泳呈现一条分离带。 经纯化后的蛋白质，应不失其生物活性。 纯的蛋白质在超速离心力场

7、中，以单一的沉降速度运动。选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。10：蛋白质含量的测定 蛋白质含量的测定是分离纯化工作中的重要部分。蛋白质测定的方法有： 紫外吸收法 利用芳香族氨基酸在280nm的吸收作用。 福林酚法（Folin法） 与福林试剂反应产生蓝色。 染料结合法（Bradford法）与考马斯亮蓝G-250反应产生蓝色。 固体样品中蛋白质含量的测定，一般用凯氏定氮法。11：核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。1

8、2：核酸的提取DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液而不溶于0.14mol/L NaCl溶液。RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/L NaCl溶液而不溶于1mol/L NaCl溶液的性质，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。13：蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为

9、溶解度小的钾盐而同时沉淀。有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇讲核酸沉淀离心收集即可。14：从RNA除去混杂的DNA，可用DNAase将DNA降解掉。从DNA中除去混杂的RNA，可用RNAase将RNA降解掉。15：核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 前者凝胶孔径小，适合分离1000

10、个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。第二章1: 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。2: 硫酸铵盐析固体法盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫酸铵的量。 （1）、计算法X=G（p2-p1）/1-Ap2 G为经验常数，0 515，20 513 A为常数 0 0.27 20 0.29P2、P1为初

11、始和最终溶液的饱和度 X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数 （2）、查表法饱和溶液法V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)；V0表示原来溶剂的体积(m1)；S1和S2含义同上；S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百)。3：有机溶剂沉淀法的优点是： 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。 其缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。4：有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法相似。盐析法的注意事项在这里同样适用。此外，还有几点需

12、要指出： (1)低温下操作：由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性，因此必须把所用之有机溶剂预冷至一1O，而且整个操作要在低温下进行。 (2)中性盐作用：加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，同时还可提高分级效果。但是，加入的量过多，则可引起蛋白质析出，影响有机溶剂的分级作用。因此，用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。 (3)多价阳离子作用：有些蛋白质和多价阳离子(如Zn2+、Cu2+等)能结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益第三章1：色谱法的优点和缺点

13、色谱法的优点分离效率高。几十种甚至上百种性质类似的化合物可在同一根色谱柱上得到分离，能解决许多其他分析方法无能为力的复杂样品分析。分析速度快。一般而言，色谱法可在几分钟至几十分钟的时间内完成一个复杂样品的分析。检测灵敏度高。随着信号处理和检测器制作技术的进步，不经过预浓缩可以直接检测 10-9g 级的微量物质。如采用预浓缩技术，检测下限可以达到 10-12g数量级。样品用量少。一次分析通常只需数纳升至数微升的溶液样品。选择性好。通过选择合适的分离模式和检测方法，可以只分离或检测感兴趣的部分物质。多组分同时分析。在很短的时间内（20min左右），可以实现几十种成分的同时分离与定量。易于自动化。现

14、在的色谱仪器已经可以实现从进样到数据处理的全自动化操作。色谱法的缺点定性能力较差。为克服这一缺点，已经发展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用。 2：按层析过程的机理分类：分配层析：溶解度离子交换层析：带电性，静电引力吸附层析：吸附力亲和层析：配体专一性凝胶层析：分子大小3：按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析

15、是一种分配层析，柱层析可做各种层析。 4：吸附剂的选择 共性：吸附剂应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 个性：在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说，极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。否则反之。要选择一个理想的吸附剂必须经过多次试验才能获得。5：吸附剂的性质前处理：先过筛，除去大的颗粒，或者用悬浮法除去细小颗粒，然后用酸、碱等溶液浸泡，接着用沸水煮，清水洗，最后用有机溶液如甲醇处理，得到既无杂质、颗粒又均一的吸附剂。6：薄层层析

16、有以下优点：1展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需1560min；2设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备；3温度变化和溶剂饱和程度对R值影响较小；4可使用腐蚀性显色剂(用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固定相的薄板除外)；5灵敏度高。 薄层层析的缺点:对生物高分子的分离效果不甚理想。7：薄层的几种类型不加粘合剂的薄层涂布法（1）氧化铝薄层 （2）纤维素薄层 （3）聚酰胺薄层 加粘合剂薄层的涂布法 硅胶G薄层 硅胶（H）羧甲基纤维钠（CMC-Na）薄层特殊薄层 酸、碱薄层和pH缓冲薄层 络合薄层 8：薄层层析注意事项a吸附剂的颗粒均匀度和大小 b薄层要均一，厚度应适中。薄层厚度一般控制在0

17、.25-0.5mm之间。 c加水量应视硅胶批号、来源而定。9： 如果薄层层析所用的支持剂是吸附剂，在同一吸附剂上，不同化合物的吸附性质有如下规律：饱和碳氢化合物不易被吸附；不饱和碳氢化合物易被吸附，分子中双键愈多，则吸附得愈紧密；当碳氢化合物被一个功能基取代后，吸附性增大。吸附性较大的化合物，一般需用极性较大的溶剂才能推动它。10：选择展开剂的另一个依据是溶剂的极性大小。一般而论，在同一种支持剂上，凡溶剂的极性愈大，则对同一性质的化合物的洗脱能力也愈大，即在薄层上能把此化合物推进得愈远，Rf值也愈大。如果用一种溶剂去展开某一成分，当发现它的Rf值太小时，可考虑换用一种极性较大的溶剂，或在原来的

18、溶剂中加入一定量极性较大的溶剂进行层析。溶剂极性大小的次序是：石油醚二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇甲醇水。11：TLC的通用显色方法 理想的显色希望灵敏度高、斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好、斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比。 在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得成尤为重要。通用显色法主要有：（1）、紫外照射法：方便，不破坏样品； （2）、碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用；（3）、荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明显； （4）、硫酸溶液：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。12：

19、定性与定量分析定性通过薄层层析被分离的各种溶质组分在滤纸上移动的速率通常用Rf表示： Rf组分移动的距离溶剂前沿移动的距离 原点至组分斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离。 在薄层、溶剂、温度等各项实验条件恒定的情况下，各物质的Rf值是不变的，它不随溶剂移动距离的改变而变化。Rf与分配系数K的关系： Rf1(1+K)，a是由薄层性质决定的一个常数。由此可见，K值愈大，溶质分配于固定相的趋势愈大，而Rf值愈小；反之，K值愈小，则分配于流动相的趋势愈大，Rf值是定性分析的重要指标。13：薄层层析在定量分析时需注意以下几点 (1)在喷雾显色时，不加粘合剂的薄层要小心操作，以免吹散吸附剂。 (2)薄层层

20、析还可以用强腐蚀性显色剂，如硫酸、硝酸、铬酸或其他混合溶液。这些显色剂几乎可以使所有的有机化合物转变为碳，如果支持剂是无机吸附剂，薄层板经此类显色剂喷雾后，被分离的有机物斑点即显示黑色。此类显色剂不适用于定量测定或制备用的薄层上。 (3)如果样品斑点本身在紫外光下不显荧光，可采用荧光薄层检测法，即在吸附剂中加入荧光物质，或在制备好的薄层上喷雾荧光物质，制成荧光薄层。这样在紫外光下薄层本身显示荧光，而样品斑点不显荧光。吸附剂中加入的荧光物质常用的有1.5硅酸锌镉粉，或在薄层上喷雾0.04荧光素钠、0.5硫酸奎宁醇溶液或1磺基水杨酸的丙酮溶液。(4)由于薄层边缘含水量不一致，薄层的厚度、溶剂展开距

21、离的增大，均会影响Rf值，因此在鉴定样品的某一成分时，应用已知标准样作对照。 (5)定量时，可对斑点作光密度测定；也可将一个斑点显色，而将与其相同Rf值的另一未显色斑点从薄层板上连同吸附剂一起刮下，然后用适当的溶剂将被分离的物质从吸附剂上洗脱下来，进行定量测定。第五章1：离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。 离子交换层析具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。2：影响离子交换选择性的因素水合离子半径：半径越小，亲和力越大；离子化合价：高价离子易于被吸附；溶液pH：影响

22、交换基团和交换离子的解离程度，不但影响交换容量；对交换选择性影响亦大。离子强度：越低越好；有机溶剂：不利于吸附；交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； 树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；3：影响交换速度的因素颗粒大小：愈小越快交联度：交联度小，交换速度快温度：越高越快,与扩散系数增加有关离子化合价：化合价越高，扩散速度小离子大小：越小越快搅拌速度：在一定程度上，越大越快溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快4：离子交换层析的基本原理若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树

23、脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱液可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。+图5-2 P655：离子交换剂性质：1 2 4书P72 3膨胀度（吸水量） 膨胀度：每g干胶在水或其他规定的溶剂中，在一定时 间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。 影响膨胀度的因素有： （1）、基质 （2）、电荷基团 （3）、离子强度和pH值6：选择离子交换剂的一般原则如下： (1) 阴、阳离子交换剂选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应

24、根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。 (2) 强、弱离子交换剂选择 强型离子交换剂适用的pH范围很广，常用来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。弱型离子交换剂适用pH范围狭窄，在pH为中性的溶液中交换容量高，用它分离生命大分子物质时，其活性不易丧失。(3) 不同离子型交换剂的选择 离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择Na型和Cl型。 另外还要保证平衡离子不对

25、样品组分有明显影响。因为在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H或OH离子，因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用H或OH型离子交换剂，因为分离过程中H或OH离子被置换出来都会改变层析柱内pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。 (4) 不同基质离子交换剂的选择 交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。7：生化用离子交换剂的特点1、亲水性和生物

26、相容性2、孔结构3、电荷密度4、粒度5、纯度8：生化用离子交换剂的种类 生化专用离子交换剂 1、纤维素类 2、葡聚糖系Sephadex离子交换剂 琼脂糖系离子交换剂等。第七章1：亲和层析原理生物亲和作用：生物物质具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性（能区分结构和性质非常相近的其它分子）。 亲和层析是利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异

27、亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来亲和吸附介质：基质+配体 P114图2：亲和作用的机理1、结构特点（必要条件）：存在凹陷和凸起结构（钥匙和锁孔的关系）2、相互作用力的存在静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键3: 影响亲和作用的因素1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子

28、：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失4: 亲和层析的基本特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件5、价格相对较昂贵；6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。5: 配体的选择配体与待分离的物质有适当的亲和力。 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落， 配体自身应具有较好的稳定性，6：1活化

29、 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 （1）、溴化腈活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。(2)、环氧基活化法

30、在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物； 在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的NC、OC 和SC 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。7：特异性洗脱方法的优点： 特异性强，分辨率高；洗脱条件温和，大分子物质不容易变性。缺点： 平衡比较慢，所以特异性洗脱往往

31、需要较常的时间和较大的洗脱条件；价格昂贵。第九章1：HPLC有以下特点：高压压力可达150-300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速流速为0.1-10.0 ml/min。高效可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。2：HPLC与经典液相色谱相比有以下 优点：速度快通常分析一个样品在15-30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合

32、物。样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。其 缺点 是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。4： HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=高效液相色谱 高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。5：高效液相色谱分析方法的一般步骤通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题： 根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效

33、液相色谱分析方法。 选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 6：化学键合固定相 将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性键合相的种类 化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。 反相键合相色谱：常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。 正相键合相色谱常用的非极性

34、键合相主要有各种烷基(C1-C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广7：选择流动相时应考虑以下几个方面：动相应不改变填料的任何性质。纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。粘度要低（应2cp）。对样品的溶解度要适宜。样品易于回收。应选用挥发性溶剂。8: 流动相的选择 正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。 反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。

35、一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185-205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。9流动相的脱气HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析

36、结果带来误差。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。10: 正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流动相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出第十二章1：基本概念： 重组DNA又称DNA克隆、分子克隆、有时也称基因克隆。重组DNA是指遗传信息按人的需要，将一种生物的基因或化学合成的基因，掺入载体，运送到另一种宿主细胞，通过载体的复制，可得到外源DNA或基因的无性繁殖和大量相应的基因产物。最终目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA）转入另一个生物体。 重组DNA操作是基因工程的核心。2：基因工程在植物上的应用 （1）基因工程改良作物的优越性：打破

37、了周期长、效率低的缺限；打破种间隔离障碍；按人们意愿改造。 （2）基因工程改良作物：基因工程在动物上的应用 转基因在动物上：转基因鼠、转基因牛、转基因猪、转基因猴、转基因兔、转基因羊。基因工程的人类基因治疗 发酵工业 理论研究3： 重组DNA的主要步骤：1、分离目的基因（DNA片段）；2、选择或构建载体；3、连接目的基因与载体；4、重组DNA导入宿主细胞和外源基因表达等4：限制性内切酶 定义 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无 HYPERL

38、INK /view/552529.htm 特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。这种能被特异性识别的切割部位都具有 HYPERLINK /view/699166.htm 回文序列，也就是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。在 HYPERLINK /view/2721.htm 基因工程中使用的多数是后一类酶。 限制性内切酶可分为三大类型： 类型I和类型III ：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。 类型II ： 是DNA重组技术最为常用的工具酶。类型II 限制性内切酶的特点 识别位点严格专一 识别序列的碱基数一般为4、6、

39、8个bp(base pair ) 识别位点经常是一种回文序列的DNA限制性内切酶的切割方式就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式有三种: 在对称轴5 侧切割产生5 粘端 在对称轴3 侧切割产生3 粘端 在对称轴处切割产生平段5：DNA聚合酶在体外合成系统中以DNA为模板，催化单核苷酸重新合成一条与模板互补的DNA序列。有以下几类： (1)DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)：DNA聚合酶I具有53聚合酶活性，35外切核酸酶活性和53外切核酸酶活性。 53聚合酶活性是能以单链DNA为模板，催化脱氧核苷酸底物合成与模板互补的DNA序列。而3 5外切酶活性则是能够除去延长的核苷酸链上的3OH

40、末端上的脱氧核苷酸。 鉴于DNA聚合酶I大片段具有上述两种催化活性，它可用于补齐限制性内切核酸酶切割产生的3凹端，以及标记DNA片段的末端。Klenow酶作用a、用于同位素标记DNA片段末端b、合成cDNA的第二条链c、Sanger双脱氧法进行序列分析d、定位突变6：核酸酶 S1核酸酶：主要用于去除DNA片段粘末端而产生平端；打开cDNA中发夹结构，使其成平端。 核糖核酸酶（RNaseA)：在质粒提取时降解RNA；从DNA-RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。7：载体 P211质粒的生物学基本特性自主复制性：不相容性：稳定性：寄生性：表现型：质粒复制类型 严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成

41、的严格控制。每个细胞拷贝数仅12个。 松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。每个细胞拷贝数甚至可高达数百个。8：质粒DNA的构型 SC构型:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构，DNA呈现超螺旋。 oc构型:两条链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现缺口，称之为开环DNA。 L构型:DNA的双链均发生断裂而形成线性分子。9：噬箘体 P21210：真核病毒P21311：构建文库的操作主要有下列4个步骤：制备DNA片段DNA片段与载体的连接重组体转化与克隆 筛选鉴定基因组12：重组DNA重组是指目的基因与载体DNA分子进行重新组合过程的简称。 连接DNA片段的方法有：黏性末端连接

42、法、平端连接法、平黏连接法、T-A连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法等。13：选择性标记基因 P22514分析基因的结构与产物 P225第十五章第十八章 1：电泳 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。电泳分离：利用荷电的溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。2：聚丙烯酰胺凝胶电泳 P3273：电渗 P364附录资料：不需要的可以自行删除 竹材重点知识1竹材及非木质材料作为原料的应用特点与局限A非木质原料应用中具有的优点来源广泛，价格低廉；原料单一，对稳定产品质量有利，生产工艺易于控制；备料工段设备简单（竹材除外）；工业生产中动力消耗较木质原料少（加工、干燥等）。

43、B不利因素原料收获季节性强。为保证常年生产，工厂需储备8-9个月的原料，而该类原料体积蓬松，占用地面与空间很大，造成储存场地之困难；原料收购局限性强。非木质原料质地松散，造成收集与运输上的不便，为降低成本，收集半径一般不超过100公里；非木质原料储藏保管较难。非木质原料所含糖类、淀粉及其它易分解的物质较木质材料高，易于虫蛀或产生霉变与腐烂（采取的措施：高密度打包储存，切段堆积储存，干燥后储存，喷洒药剂储存等，但增加了工序和成本）；非木质原料含杂杂物多（蔗渣含20%以上的蔗髓，棉杆含残花和泥沙，芦苇有苇髓和叶鞘，稻壳含米坯等），对产品质量有影响，生产前应分离，增加了工序与成本；其它尚未解决的问题

44、：棉杆皮韧性大，缠绕设备造成堵塞、起火；原料易水解，湿法生产中造成的污染大；稻壳板硬度大，对刀具磨损十分严重等，目前尚无参考模式，有待进一步研究克服。2.分布概况： 竹子是森林资源之一。中国竹类资源分为四个区：黄河-长江竹区、长江-南岭竹区、华南竹区、西南高山竹区。3地下茎：竹类植物在土中横向生长的茎部，有明显的分节，节上生根，节侧有芽，可萌发而为新的地下茎或发笋出土成竹，俗称竹鞭，亦名鞭茎。因竹种不同，地下茎有下列三种类型：单轴型、合轴型、复轴型。4.竹秆：竹秆是竹子的主题部分，分为秆柄、秆基和秆茎三部分。1）秆柄：竹秆的最下部分，与竹鞭或母竹的秆基相连，细小、短缩、不生根，俗称螺丝钉或龙眼

45、鸡头，是竹子地上和地下系统连接输导的枢纽。2）秆基：竹秆的入土生根部分，由数节至10数节组成，节间短缩而粗大。秆基各节密集生根，称为竹根，形成竹株独立根系。秆基、秆柄和竹根合称为竹蔸。3）秆茎：竹秆的地上部分，端正通直，一般形圆而中空有节，上部分枝着叶。每节有两环，下环为箨环，又叫鞘环，是竹箨脱落后留下的环痕；上环为秆环，是居间分生组织停止生长后留下的环痕。两环之间称为节内，两节之间称为节间。相邻两节间有一木质横隔，称为节隔，着生于节内。竹秆的节、节间形状和节间长度因竹种而有变化。5.竹子各部位之间的关系 竹连鞭，鞭生芽，芽孕笋，笋长竹，竹又养鞭，循环增殖，互为因果，鞭竹息息相关的统一有机整体

46、。6竹林的采伐竹林采伐时必须做到“采育兼顾”，才能达到竹林永续利用、资源永不枯竭之目的。正确确定伐竹年龄、采伐强度、采伐季节、采伐方法四个技术环节是竹林采伐的关键所在。7.采伐竹龄：竹林为异龄林，一般只能采取龄级择伐方式，根据竹类植物的生长发育规律，竹笋成竹后，秆形生长基本结束，体积不再有变化，但材质生长仍在进行，密度和力学强度仍在增长和变化，根据其变化情况可分为三个阶段，即材质增进期，材质稳定期和材质下降期。竹子的采伐年龄最好在竹材材质稳定期，遵循“存三（度）砍四（度）不留七（度）”的原则。8.伐竹季节：春栽夏劈秋冬伐。 一般竹林应该在冬季采伐，应在出笋当年的晚秋或冬季（小年春前）。花年竹林

47、，应砍伐竹叶发黄、即将换叶的小年竹，而不应砍伐竹叶茂密正在孵笋的大年竹；丛生竹林，一般夏秋季节出笋，采伐季节选在晚秋或早春，使新竹能发枝展叶。 原因：a.该季节竹子处于休眠状态，竹液流动慢，同化作用较弱； b.可溶性物质变成复杂的有机物储存，竹材力学性质好，不易虫蛀； c.冬季，林地中主要害虫处于越冬状态，不会对采伐后的竹林造成伤害； d.该季节新竹尚未发出，可避免采伐时造成损伤。9.竹材的储藏与保管具体要求：1）按照不同质量分类保管；2）按照规格大小，分别存放；3）先进先出，推陈出新；4）防虫防蛀，喷熏药物。10.竹材的缺陷及其发生规律：1）虫蛀和霉腐一般发生规律如下：a.竹黄较竹青严重；b

48、.6-7年生竹材较轻，3-5年生以下较重；c.冬季采伐的较轻，秋季次之，春季采伐的较重；e.山地生长的较平地生长的轻；f.通风透光储藏遭受损害的较少，阴暗不透风的则多。11.竹壁：竹秆圆筒状的外壳。一般根部最厚，至上部递减，自内向外分为竹青、竹肉和竹黄三个部分。 12.影响竹材密度的因素：竹种：与其地理分布有一定的关系，分布在气温较低、雨量较少的北部地区的竹材（如刚竹）密度较大，反之，则密度较小。竹龄：随着年龄的增长，密度不断的提高和变化（因竹材细胞壁和内容物是随竹龄的增加而逐渐充实和变化的），可根据其规律性作为确定竹材合理采伐年龄的理论依据之一。立地条件：气候温暖多湿，土壤深厚肥沃的条件下生

49、长好，竹竿粗大，但组织疏松，维管束密度小，从而密度小，反之密度大。竹秆部位：同一竹种，自基部至稍部，密度逐渐增大，同一高度上，竹壁外侧高于内侧，有节部分大于无节部分。13竹材特性竹材与木材相比，具有强度高、韧性大，刚性好、易加工等特点，使竹材具有多种多样的用途，但这些特性也在相当程度上限制了其优越性的发挥，竹材的基本特性如下：1）易加工，用途广泛：剖篾、编织、弯曲成型、易染色漂白、原竹利用等；2）直径小，壁薄中空，具有尖削度：强重比高，适于原竹利用，但不能像木材一样直接进行锯切、刨切和旋切，经过一定的措施可以获得高得率的旋切竹单板和纹理美观的刨切竹薄木；3）结构不均匀：给加工利用带来很多不利影

50、响（如竹青、竹黄对胶粘剂的湿润、胶合性能几乎为零，而竹肉则有良好的胶合性能；4）各向异性明显：主要表现在纵向强度大，横向强度小，容易产生劈裂5）易虫蛀、腐朽和霉变：竹材比木材含有更多的营养物质造成；6）运输费用大，难以长期保存：壁薄中空，体积大，车辆实际装载量小，不宜长距离运输；易虫蛀、腐朽和霉变，不宜长时间保存；砍伐季节性强，规模化生产与原竹供应之间矛盾较为突出。14. 竹材人造板的构成原则：以克服竹材本身固有的某些缺陷，使竹材人造板具有幅面大且不变形、不开裂等特点为出发点的，主要遵循以下两个原则：对称原则：对称中心平面两侧的对应层，竹种、厚度、层数、纤维方向、含水率、制造方法相互对应。奇数

51、性原则：主要针对非定向结构的多层人造板15.竹材人造板的结构特性：1）结构的对称性：尽可能的克服各向异性2）强度的均齐性：材料在各个方向强度大小的差异，以均齐系数表达（竹纤维板、碎料板趋于1）。 3）材质的均匀性：能提高板材外观质量，也可减少应力集中造成的破坏。(板材优于竹材，结构单元越小的板材均匀性越好).16.胶层厚度：不产生缺胶的情况下，越薄越好（2050微米）？1）薄胶层变形需要的应力比厚胶层大2）随着胶层厚度的增加，流动或蠕变的几率增大3）胶层越厚，由膨胀差而引起界面的内应力与热应力大4）坚硬的胶粘剂，胶合界面在弯曲应力的作用下，薄胶层断裂强度高5）胶层越厚，气泡或其他缺陷数量增加，

52、早期破坏几率增加17. 竹材胶合板：是将竹材经过高温软化展平成竹片毛坯，再以科学的、比较简便的、连续化的加工方法和尽可能少改变竹材厚度和宽度的结合形式获得最大厚度和宽度的竹片，减少生产过程中的劳动消耗和胶粘剂用量，从而生产出保持竹材特性的强度高、刚性好、耐磨损的工程结构用竹材人造板。竹材的高温软化-展平是该项工艺的主要特征。A原竹截断截断：先去斜头；由基至稍，分段截取；截弯存直，提高等级；留足余量。B竹片软化的目的：将半圆形的竹筒展平，则竹筒的外表面受压应力，内表面受拉应力，其应力大小为：=ES/2r减小E值是减小竹材展平时反向应力的有效手段，从而可以减少展平时竹材内表面的裂缝的宽度和深度。减

53、小竹材弹性模量的方法和措施统称为竹材软化。C.软化方法 ：在目前的技术条件下，提高竹筒含水率和温度是提高竹材本身塑性、减小竹材弹性模量，从而达到减小展开过程中方向弯曲时拉伸应力的有效措施。D.刨削加工目的：1）去青去黄，改善竹材表面性能，提高胶粘效果； 2）使竹片全长上具有同一厚度，以获得较高胶粘性能和较小的厚度偏差。E.竹片干燥: 实践证明，使用PF时，竹片的含水率应低于8%，而使用UF时，应小于12%，才能获得理想的胶合强度。预干燥：目的为了提高竹片的干燥效率，主要设备是高效螺旋燃烧炉竹片干燥窑，干燥周期较长，一般10-12小时，终含水率由35-50%降至12-15%。定型干燥：因竹片是由

54、圆弧状经水煮、高温软化、展平而成平直状，但在自然状态中仍具有较大的弹性恢复力，故需采用加压的干燥和设备。F组坯：将面、背板竹片和涂过胶的芯板竹片组合成板坯的过程成为组坯。1）板坯厚度的确定：s=100s合/（100-）式中：s为板坯厚度（各层竹片厚度之和，mm），s合为竹材胶合板厚度（mm），为板坯热压时的压缩率（%）。板坯的压缩率与热压时的温度、压力和竹材的产地、竹龄等多种因素有关。通常温度为140-145，单位压力为3.0-3.5Mpa时，板坯的压缩率为13.0%-16.0%。2）组坯操作注意事项：a. 面、背板竹片应预先区分好。b.组坯时芯板与面、背板竹片纤维方向应互相垂直。面板与背板竹

55、片组坯时，竹青面朝外，竹黄面朝内；芯板竹片组坯时，为防止竹材胶合板由于结构不对称而产生变形，应将每张竹片的竹青、竹黄的朝向依次交替排列。c.竹片厚度较大，宽度较小（平均100毫米左右），涂胶量不大，因而其吸水膨胀值（绝对值）不大，故芯板组坯时不必留有吸水膨胀后的间隙，只需将竹片涂胶后紧靠排列即可。d.组坯时面、背板及芯板竹片组成的板坯要做到“一边一角一头”平齐，可为锯边工序提供纵边和横边两个基准面。G热压胶合1)工艺过程：竹片涂胶以后组成板坯，经过加温加压使胶粘剂固化，胶合成竹材胶合板的过程称为热压胶合，这是一个十分复杂的物理和化学变化过程。可压力变化情况可分为三个阶段：A第一阶段：从放第一张板坯进入热压板至全部热压板闭和并达到要求的单位压力，称为自由加热期。B第二阶段：从热压板内的板坯达到要求的单位压力至降压开始，称为压力保持期；C第三阶段：从热压板的板坯降压开始到热压板全部张开，称为降压期。在降压期，因压力降低，板坯中的水蒸气急剧向外溢散，同时呈过热状态的水