激光共聚焦烟草

1、实_业姓狄晨学日期地点农生B-课程称细胞生实_业姓狄晨学日期地点农生B-课程称细胞生物学实验指导老师安千成绩激光扫共聚焦显微镜工作原理及用稻瘟菌 实验类型验组学生姓鲁楠一1实验目的和要求必填21了解绿色荧光蛋白green fluorescent proteinGFPV子用于监测靶因的装线31掌握用激光扫共聚焦显微镜成像的要素并检测 GFP 标记蛋白在真菌细胞内的定 二1实验内容和原理必填11荧光荧光是物质V子中的电子吸收了光的能由P能态跃迁到高能态再回到的光2激能发射荧光的物质被称荧光物质2荧光物质激回到态过程中除发射荧光外能以w它形式如热能和磷能即有能损失也即光物质吸收高能短光而发射P能长荧

2、光2而对于一些非荧光物质以通过或称荧光探针结合或反而化荧光物质个过程被称荧21荧光显微镜工作原理光源发的光线通过激发滤镜ion filterV滤定长范围的激发光2激发光被二向色镜或称V色镜dichroicirror改方向通过物镜照射品激发品发射长荧光2来自品的荧光通过V色镜而来自rblockfilter,阻断短光进入目镜231激光扫共聚焦显微镜的工作原理LSCM 是在荧光显微镜础P用激光激发点扫和用共聚焦装置焦点荧光信排除非焦点的荧光信从而实光即LSM是集荧光显微高性能算机和数_图像处理体的高精度显微成像系统激光共聚焦显微镜成像原理在光源和检测器前各有一个针孔 pinhole或称孔光栏V别称照

3、明针孔illmintionpinhol和检测针孔detetionpinhol 2由激光光物质激而发射的荧光经物镜和V光器beamspliter通过检测针孔到达检测器光电倍增管 PMT2通过照明针孔和检测针孔的光线经一系列的镜都聚焦于焦点2焦点既PMT检测到的由激光点扫焦面而发射的荧光信被算通过显微镜P装置的微步进马达驱动载物在垂直方向z轴移动x有穿性的激光能对厚品表面Q一定深度的区域进行连续光学W片进而由算机数_图xy二维图像建品的O维结构2V子用于检测靶因表达和靶蛋白最大荧光吸收/395 nm475 nm 有一个肩峰荧光发射峰508 nm2GFP GFP O需要外物和辅因子GFP 生色团的形

4、成是自催化的, 检测FP Ser6rl7 l酸残的码序列产生了O的改了吸收和发射光谱从蓝到黄P 突体如(enhaced) FP , 8 m , 8 2P蛋白作内V子被广泛用于监测靶内的V布和态2本实验中所GFP 生色团O点及空间P相邻的l酸通过突码酸序列的碱被改了对码 GFP 的酸序列做了w他修改以适合 GFP 因在真菌细胞或植物O1实验材料P试剂必填组成型表达连有内质网定O序列的 GFP的因烟草 16c无菌水211养烟草老师完成1开机LASAF LeicaApplication Suite Advanced Fluorescence 程序路设置激发光488nm所检测的发射光500550nm或

5、更500530nm23用倒置荧光显微镜的P倍I3 滤块cube激发长 450490 nmV510 nm发射长大于 515 nm预览调焦找到有发绿色荧光区域24往数1.4 63 倍油物镜镜头P滴少无荧光浸油用油镜找到所要观察的区域5点Live 用标准扫频400 Hz1像素V辨512512dpi 和针孔径度1 Airy 预扫调节焦面1激光强度1PMT 电压增gain 值和offset 值在预览到适度的所观测的图像选用像素V辨率 10241024 dpi1P频 200 Hz 和线均 line average 3点Capture 扫成像26将获得的清晰图像以 TIFF 格式输储七1实验结果七1实验结果PV注释ERendoplasmicreticulum 内质注释ERendoplasmicreticulum 内质Nnuclear 细胞CVcentral箭头所指细胞生型烟草中未检荧光标记而在突体中GFP P内质网定O序列形成融合因液所以在烟草突体中以看到被 GFP 标记的内质网时以证明 GFP