广西地方标准《猪链球菌2型抗体的检测 酶联免疫吸附法》编制说明

1、 广西地方标准猪链球菌2型抗体的检测 酶联免疫吸附法（送审稿）编制说明1、项目来源本标准来源于广西壮族自治区市场监督管理局关于下达2021年第二批广西地方标准制修定项目计划的通知（桂市监函20212199号）文件，由广西动物疫病预防控制中心承担。广西动物疫病预防控制中心“猪链球菌2型抗体的检测 酶联免疫吸附法”编写小组，按GB/T1.1 2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的要求组织编写的。计划于2022年完成。2、目的意义猪链球菌病是通过接触病猪或病猪产品引发的一种人兽共患传染病。病原猪链球菌血清型众多，其中猪链球菌2型为最常见和毒力最强的血清型。人感染猪链球菌主要是

2、通过创口感染，导致脑膜炎、中毒性休克综合征等疾病，甚至引起死亡，带来严重的公共卫生问题。近年来，与广西毗连的越南和泰国等东盟国家均有报道人感染猪链球菌2型并死亡的病例。美国、英国、葡萄牙、澳大利亚、荷兰等国也相继出现了人感染猪链球菌的报道。在越南和我国香港地区，猪链球菌已成为引起成人脑膜脑炎的第一和第三大病原。统计数据表明，全球因猪链球菌感染已引致400人以上死亡，其感染和发病有逐年增多的趋势。因此，预防猪链球菌病不仅是全世界养猪业的迫切需求，也是全球公共卫生急需解决的焦点问题。我国猪链球菌病疫情也十分严峻，病原主要以猪链球菌2型（SS2）和马链球菌兽疫亚种（SEZ）为主。1998年夏季江苏南

3、通地区及2005年7月四川资阳地区，由猪链球菌2型感染猪群出现暴发性死亡事例，并引起多名相关从业人员死亡，一度引发极大的社会恐慌。而近几年来，广西人感染猪链球菌发病数呈逐年上升趋势，20182020年广西分别有34、65、95人感染猪链球菌2型并发病。广西是养猪大省，年平均气温高、环境湿度大，利于猪链球菌2型的扩散传播，且广西防城港、百色、崇左3个地级市中的8个县（市）与越南交界，陆地边境线长1020公里。边境地区山林密布，野生动物众多。越南等东南亚国家由于防控水平低，猪链球菌病等人兽共患病可能通过野生动物的跨境活动和动物及动物产品的非法贸易传入广西乃至国内。因此，在广西开展家畜及野生动物猪链

4、球菌检测项目的研究，尤其是猪链球菌2型的研究及诊断方法的开发。不仅能掌握野生动物携带猪链球菌的情况，更能有效遏制东南亚疫情的传入，对猪链球菌病等人兽共患病的防控具有十分重要的意义。动物机体在被动免疫或感染病原后会相应产生特异性抗体，通过检测抗体，监视其变化情况可以评价预防接种效果、协助临床诊断、观察疗效、判断预后，有助于流行病学调查。及时、快速、准确的检测动物的猪链球菌2型抗体，具有重要作用。然而，当前国内外检测猪链球菌2型尚无统一的标准，各类检测方法良莠不齐，不能对猪群感染链球菌或免疫猪链球菌疫苗后产生的抗体进行有效监测。亟需建立一种针对猪链球菌2型抗体的特异性强、敏感性好、高效率、低成本的

5、检测方法，从而快速诊断机体感染状况，及时制定相应的防控策略，对保护易感猪群、高危人群具有非常重要的意义。3、国内外标准对比情况通过检索美国标准及英国标准未有查询到具体的猪链球菌抗体检测相关标准。当前，国内外猪链球菌2型抗体检测技术有琼脂扩散试验、间接血凝、免疫胶体金检测方法。但是，上述方法在实际应用中尚存在一定的不足或缺陷。如：琼脂扩散试验耗时太长、敏感性较低；间接血凝试验受电解质、温度、酸碱度影响较大，结果不稳定；免疫胶体金检测结果不稳定，容易出现假阳性和假阴性，而且没有相关检测标准，影响猪链球菌2型抗体的准确检测。猪链球菌2型感染动物机体后会产生特异性抗体，酶联免疫吸附试验（ELISA）通

6、过将抗原吸附在固相载体，在载体上进行免疫酶反应，通过底物显色，用分光光度计判定结果。利用抗原抗体特异性和酶催化反应的高灵敏性，有效的建立了猪链球菌2型抗体检测方法，操作简便、准确性高、耗时少，适合快速检测猪链球菌2型抗体，用于家畜及野生动物猪链球菌2型感染流行病学调查以及疫苗免疫效果评估。但该方法目前国内外没有相关的统一标准，本课题组制定标准建立相应的检测规程，作为研究工作的重点，并承诺本标准内容与各项指标不低于国家强制性标准、推荐性国家标准和行业标准。4、编制过程 （1）接到任务后，广西动物疫病预防控制中心结合近几年的科研情况和人员情况，成立了以韦显凯为组长， HYPERLINK /egra

7、ntweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&郑敏、 HYPERLINK /egrantweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT

8、9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&闭璟珊、 HYPERLINK /egrantweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&周庆安、张灿星、李军等同志为成员的标准编制课题组，负责标准的起草工作。

9、（2）为了确保制定的标准具有科学性、先进性、实用性和可操作性，标准编制课题组根据工作方案和任务要求进行了分工，分成2个小组，其中一个小组负责做生产实践的调查研究，深入到广西南宁、来宾、柳州、河池、梧州、贺州、玉林、北海、百色、桂林、崇左等地一些规模化猪场、散养户及屠宰场进行实地调查研究，了解我区生猪养殖链球菌病防控有关情况，并查阅相关的技术档案和规章制定，收集流行病学资料；另一个小组负责查阅国内外猪链球菌检测方面的标准、技术资料和研究报告，并进行实验比对。（3）起草完成标准征求意见稿最后课题组将两个小组收集的材料进行汇总和整理，起草完成标准征求意见稿。（4）广泛征求意见，形成网上征求意见稿20

10、22年4月将标准征求意见稿（1稿），分别送有关生产、技术推广、科研、教学和标准化等方面专家征求意见。发出征询专家意见表8份，收回8份，8位专家提出了修改意见65条，采纳59条。根据专家意见修改完善标准征求意见稿，形成网上征求意见稿。5、关键技术指标依据和来源广西动物疫病预防控制中心长期致力于广西地区动物疫病防控研究，承担了大量的疫病防控研究工作，从人员配备以及仪器设备等均符合项目开展的需要。课题组长期承担广西壮族自治区动物疫病预防控制中心业务项目猪链球菌病流行病学调查与防控，对广西地区生猪链球菌病的流行情况有系统深入的调查，掌握了大量第一手的流行病学实践数据。为夯实制定标准的科学依据，项目组对

11、广西猪链球菌病进行了系统流行病学调查及数据总结, 重点了解广西生猪猪链球菌病的感染率、感染强度、血清型以及耐药性。20132018年，广西动物疫病预防控制中心承担了国家公益性项目“猪链球菌病防控技术研究与示范”的子课题，20152017年，承担了原广西水产畜牧兽医局科技推广项目“中越边境猪链球菌病防控研究与示范”。与南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室以及OIE猪链球菌病诊断实验室密切合作，对中越边境的猪链球菌病进行监测和防控。发现菌株GX10对昆明小鼠和BALB/c小鼠致死率均为100%，菌株GX11对BALB/c小鼠致死率80%，菌株GX10、GX11对BALB/c小鼠的LD50

12、分别为4.5105 CFU、3.6109 CFU。表明广西BALB/c小鼠对猪链球菌的敏感性高于昆明小鼠，更适合作为猪链球菌致病性研究动物模型，详见表1和表2。表1 部分菌株对昆明小鼠和BALB/c小鼠致病性试验Table 1 Pathogenicity test of different strains to Kunming mice and BALB/c mice组别 Group血清型 Serum type攻毒数（只）Offensive number死亡数（只） Number of deaths昆明小鼠 Kunming miceBALB/c小鼠BALB/c miceGX75500GX915

13、00GX108555GX112504GX1229500其他型其他5500HA98012503生理盐水组500表2 对BALB/c小鼠有致病性的菌株不同浓度的毒力试验Table 2 Test of different concentration of pathogenic bacteria in BALB/c mice组别 Group攻毒数（只） Offensive number死亡数（只） Number of deathsGX10 GX11HA9801原液5534105423105200105000生理盐水5000本研究建立的猪链球菌2型抗体ELISA方法可应用于监测猪群的猪链球菌2型感染状况

14、，同时用于评估疫苗免疫后的效果。运用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒连续5年对东兴市、那坡县、大新县的屠宰场和免疫猪场进行猪链球菌2型抗体水平进行监测，其中屠宰场每个示范每年监测300份血清，免疫猪场每个示范每年监测100份以上血清。屠宰场猪链球菌2型抗体平均阳性率为27.00%，免疫猪场猪链球菌2型抗体平均阳性率为93.37%，屠宰场和免疫场血清猪链球菌2型抗体平均阳性率差异显著（P0.01），详见表3。表3. 2016-2020年屠宰场和免疫猪场猪链球菌2型抗体监测结果Table 3. Detection results of Streptococcus suis type 2 ant

15、ibody in slaughterhouses and immunized pig farms, 2016-2020年份 Year屠宰场 HYPERLINK javascript:void(0); Slaughter HYPERLINK javascript:void(0); house 免疫场 Immune field样品数 HYPERLINK javascript:void(0); Sample HYPERLINK javascript:void(0); number阳性数 Positive number阳性率（%） HYPERLINK javascript:void(0); Posit

16、ive HYPERLINK javascript:void(0); incidence（%）样品数 HYPERLINK javascript:void(0); Sample HYPERLINK javascript:void(0); number阳性数 Positive number阳性率（%） HYPERLINK javascript:void(0); Positive HYPERLINK javascript:void(0); incidence（%）201690024927.67 38035292.63 201790024627.3336534193.42201890022625.113

17、5032693.14201990023826.4434031291.76202090025628.4436034595.83合计4500121527.00a1795167693.37b注：标注不同字母代表P0.01，差异极显著。此外还通过向各地养殖场(户)发放调查表格, 调查生猪发病情况, 同时到各县市的动物疫病预防控制中心调查当地生猪发病情况记载、疫情报告表和检疫记载等，并采集样品检测猪链球菌2型和常见猪病的混合感染状况。综合流行病学调查以及实验室检测，发现在猪常见疾病中，链球菌2型病感染率仅次于PCV2、PRRSV，平均感染率达10.88%，其中在发病场和屠宰场的检出率分别为11.84%和

18、10.11%。详见表4。表4 6种疫病检测结果Table 4 Result of 2 disease detection样品来源sample source样品数目Sample numberSS2阳性率(%)positve rateCSFV阳性率(%)positve ratePRRSV阳性率(%)positve ratePEDV阳性率(%)positve ratePCV2阳性率(%)positve ratePRV阳性率(%)positve rate发病场morbidity farms15211.84(18)1.97(3)16.45(25)034.21(52)3.95(6)屠宰场slaughter

19、 houses18810.11(19)0.53(1)11.17(21)043.09(81)0(0)合计34010.88(37)1.18(4)13.53(46)039.12(133)1.76(6)分析SS2和病毒混合感染情况，在发病场中，PCV2和其他病原的混合感染最为多见。其中，感染最高的是CSFV+PCV2，达到3.95%，其次为PRRSV+PCV2，阳性率为3.29%，PCV2+SS2的阳性率为1.31%。屠宰场二重感染较多的感染最高的是PRRSV+PCV2，达到2.66%，其次为PCV2+SS2，阳性率为1.06%。详见表5表5 二重感染情况Table 5 Status of doubl

20、e infection检测项目Dtection item发病场 morbidity farms屠宰场slaughter houses合计 total样品数Sample number阳性数positive number阳性率(%)positve rate样品数Sample number阳性数positive number阳性率(%)positve rate阳性数positive number阳性率(%)positve ratePCV2+SS215221.3118821.0641.17PRRSV+CSFV10.6610.5320.59PRRSV+PCV253.2952.66102.94CSFV+P

21、CV263.950061.76本研究选取了平果县的的凤梧乡百丰村兴隆土猪养殖场、坡造镇绿德村布觉屯潘福春猪场以及四塘镇红福养猪场作为免疫示范猪场进行免疫，跟踪研究免疫抗体水平产生规律。使用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒对3个猪场，不同时间阶段的180份猪血清进行猪链球菌2型抗体的检测。检测结果如表6。实验结果表明，仔猪注射猪链球菌2型疫苗后能够产生猪链球菌2型抗体，且免疫30 d后，抗体水平最高，免疫60 d后抗体水平逐渐降低。如果仔猪不进行猪链球菌疫苗免疫，仍然能够产生猪链球菌2型抗体，但抗体水平较低。表6 猪血清样品的猪链球菌2型抗体的ELISA检测结果Table 6 The results of ELISA detection of streptococci 2 antibodies in pig serum samples组别 Group一免前 Before the first immunization二免前 Before the second immunization二免后30天 30 days after the second exemption二免后60天 60 days after the second exemption抗体阳性数 Antibody positive number抗体阳性率（%）Antibody pos