高效液相色谱法测定不同产地蜂房中酚酸类成分的含量

1、高效液相色谱法测定不同产地蜂房中酚酸类成分的含量【关键词】HPL；蜂房；没食子酸；对羟基苯甲酸；原儿茶酸蜂房NidusVespae为胡蜂科昆虫果马蜂Plisteslivaeus(DeGeer)、日本长脚胡蜂PlistesjapniusSaussure或异腹胡蜂ParaplybiavariaFabriius的巢。2022年版?中国药典?中记载蜂房具有“祛风，攻毒，杀虫，止痛的作用1。?中药大辞典?中记载蜂房药液具有“去腐、生饥消炎、止痛等作用，并能促进创口早期愈合2。近年来国内多篇文献报道蜂房临床疗效显著，大多数集中于抗肿瘤与抗炎两个方面，已有文献明确指出抗肿瘤物质根底在于它所含有的极性低的脂肪

2、酸类3，而关于抗炎作用的物质根底研究报道甚少。本科室研究发现，蜂房的水煎液具有抗炎活性，而正丁醇提取物抗炎活性明显，主要有效成分为酚酸类和少量的含氮类化合物，但没有进展关于蜂房抗炎成分的质量控制方法的研究。为了进一步对蜂房药材进展科学评价，本研究对16批蜂房药材进展了HPL比拟分析，首次建立了同时测定蜂房药材中主要成分没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸含量的方法4，为蜂房药材质量控制提供了借鉴。1仪器与试药高效液相色谱仪：aters600E泵，atersPAD996二极管阵列检测器；旋转蒸发仪SB1000,N1000,日本东京理化株式会社；紫外分光光度仪UV2501P，日本Shiadzu公司；电

3、子分析天平UV120D，日本Shiadzu公司。高效液相色谱用试剂：甲醇(色谱纯)，水(三蒸水)，三氟乙酸(分析纯)；没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号：110836-202202、110648-202218、110754-202207)。实验室用药材，由沈阳药科大学中药教研室孙启时教授鉴定为蜂房NidusVespae。2方法与结果2.2供试品溶液的制备称取剪碎的蜂房药材(辽宁沈阳)2g，用20倍水煎煮3次，水煎液用滤纸过滤，所得滤液浓缩至约10l；将浓缩液醇沉12h，之后过滤得醇沉液；醇沉液减压浓缩至无醇味，用水25l分次定量转移至分液漏斗中，正丁醇等体积萃

4、取3次，萃取液合并，旋转蒸发至干，用甲醇溶解并定容至10l容量瓶中，微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。2.3对照品溶液的制备精细称没食子酸对照品8.0g、对羟基苯甲酸对照品7.6g和原儿茶酸对照品11.1g,分别置于10l容量瓶中，用甲醇溶液并稀释到刻度，摇匀即得，作为对照品储藏液。分别精细汲取上述贮备液1.0l，置同一10l量瓶中，用甲醇溶液并稀释到刻度，摇匀即得，作为对照品溶液。2.4线性关系的考察精细汲取对照品溶液0.04，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，1.8l，分别置于2l量瓶中，用甲醇溶液并稀释到刻度，摇匀，分别进样5l。以各成分峰面积为纵坐标Y，质量浓

5、度为横坐标X,绘制标准曲线，计算回归方程：Y没食子酸=8.97106X+7317.1,r=0.9996,线性范围1.672.0g/l；Y对羟基苯甲酸=1.95107X-73247,r=0.9995,线性范围1.5268.4g/l；Y原儿茶酸=5.01107X-169012，r=0.9998，线性范围2.2299.9g/l。2.5精细度实验取同一供试品溶液，分别连续进样6次，测定没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸峰面积，结果RSD分别为0.41，0.56%和0.72，均小于2，说明仪器精细度良好。2.6重复性实验取同一批蜂房样品6份辽宁沈阳，按供试品溶液的制备方法制备成6份，分别进样5l，结果，没

6、食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸峰面积的RSD分别为0.83，0.74%和0.95，均小于2，说明方法重复性良好。转贴于论文联盟.ll.2.7稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，24h进样5l。结果，没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸的峰面积的RSD分别为1.72，1.61%和2.19，均小于5，说明供试品溶液在24h内稳定。2.8回收率实验精细称取6份含量的辽宁沈阳蜂房没食子酸含量0.256gg-1，对羟基苯甲酸0.365gg-1，原儿茶酸0.327gg-11g,分别参加没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸对照品溶液适量，按“2.2项下操作，计算回收率。结果没食子酸平均回收率98.

7、9%，RSD=1.01%；对羟基苯甲酸平均回收率98.4%，RSD=1.18%；原儿茶酸平均回收97.3%，RSD=1.18%。结果见表1。表1回收率测定结果略2.9不同产地样品测定分别取不同产地的蜂房1g，按照“2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样5l，测定峰面积，根据标准曲线计算样品中没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的含量。结果见表2。表2样品来源及含量测定结果略3讨论3.1检测波长的选择采用aters二级管阵列检测器对检测波长进展了选择，首先从中选出243，254，261n3个别离度较好的波长，然后进一步通过分析比拟这3个波长下的图谱，发现检测波长为254n时，3种酚酸均有最大吸收，且

8、色谱峰别离较好，基线较平稳。3.2流动相的选择化合物在色谱柱上的保存行为与其化学构造有关，没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸化学构造有着一定差异，对羟基苯甲酸、原儿茶酸保存时间远大于没食子酸，等度洗脱不适宜同时测定这3种成分，故采用梯度洗脱，可缩短分析时间，同时定量3个成分；分别用甲醇-水(加三氟乙酸、乙腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲体系为流动相，以不同梯度进展试验，结果说明用甲醇-水三氟乙酸调pH至5线性梯度洗脱效果最好。3.3提取条件的选择蜂房提取选用传统的水煎醇沉工艺，但要考虑选加水量、煎煮时间、煎煮次数和醇沉浓度的因素，选用L9(34)正交方案，系统考察了4个因素对蜂房提取工艺的影响，选定蜂房

9、最优提取工艺，即每次用20倍量的水煎煮3次，总提取时间为4h，醇沉浓度为60%。3.4提取溶媒的选择通过对提取溶媒的考察，蜂房水煎液的正丁醇提取物抗炎活性明显；此外，通过对蜂房水煎液正丁醇提取物与水层图谱比拟，没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的峰面积显著进步，杂质明显减少。蜂房水煎液的正丁醇层提取物，不仅有利于3种酚酸类化合物的含量测定，更有利于不同产地蜂房抗炎活性的比拟。本实验建立了蜂房药材中没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的含量测定方法，该方法方便、快捷、可靠；结果说明不同产地蜂房中3种酚酸的含量存在一定差异，以辽宁丹东、湖南和广东中山蜂房药材中3种酚酸的含量较高，考虑的可能因素有产地、加工、采用季节、储存时间和方式等。【参考文献】1国家药典委员会.中国药典，部S.北京:化学工业出版社，2022:249.2